[发明专利]一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。本发明提供的永生化猪巨噬细胞株为将永生化基因SV40LT和hTERT通过慢病毒感染的方式共转染入原代猪骨髓源性巨噬细胞中获得，提供的永生化猪巨噬细胞株是一种适用于培养非洲猪瘟病毒且可以获得高病毒滴度的可靠、稳定且可连续传代的永生化猪巨噬细胞株，可以有效应用在猪抗非洲猪瘟病毒感染方面的免疫学研究以及非洲猪瘟病毒疫苗生产中。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用，具体涉及一种适用于培养非洲猪瘟病毒的永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用，尤其涉及一种适用于培养非洲猪瘟病毒且可以获得高病毒滴度的可靠、稳定且可连续传代的永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和在猪抗非洲猪瘟病毒感染方面的免疫学研究以及非洲猪瘟病毒疫苗生产中的应用。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是非洲病毒科中唯一的非洲病毒属，也是目前唯一的DNA虫媒病毒属。该病毒主要靠口或鼻腔直接接触感染，同时拥有多个循环传播方式，主要存在于血液、组织液、内脏、分泌物和排泄物中，具有感染率高，传播迅速，致死率高等特点，对全球养猪业造成了巨大经济损失。

在非洲猪瘟常态化防控中，疫苗是适用性较强且相对有效的预防方法，故而，安全、有效、质量稳定的非洲猪瘟病毒疫苗将使猪场遭受非洲猪瘟的概率大幅降低。目前，用于非洲猪瘟病毒体外培养和疫苗研究的细胞为猪原代巨噬细胞，其主要来源为从猪肺脏分离而得的猪肺泡巨噬细胞和从猪骨髓分离并诱导而来的猪骨髓源性巨噬细胞。然而，随着近年来猪病疫情的日趋复杂，分离的猪原代巨噬细胞存在外源病毒、细菌、真菌及支原体污染的风险，这些外源因子的污染可能对非洲猪瘟病毒的体外培养及其疫苗的安全性和效力均构成严重影响和威胁。此外，由于猪的个体差异，分离的猪原代巨噬细胞的数量和对非洲猪瘟病毒的敏感性也有很大差异，因此对非洲猪瘟病毒的体外培养以及疫苗研究和生产(例如造成疫苗质量不稳定)造成了较大的限制。

已知通过基因工程技术手段构建的永生化细胞可以避免分离的原代细胞存在外源病毒、细菌、真菌及支原体污染的风险，并且构建获得的永生化细胞由于是单克隆细胞且连续传代稳定，因此对利用其培养的病毒的敏感性一致，进而可以保证生产的疫苗的质量稳定。故而，构建一株适用于培养非洲猪瘟病毒的可靠、稳定且可连续传代的永生化猪巨噬细胞对于非洲猪瘟病毒的体外培养和疫苗生产具有重大的意义。虽然现有技术中已经存在永生化猪巨噬细胞，例如专利文献CN105793416A公开的永生化猪肺泡巨噬细胞(以下称文献1)，和Mingeun Sagong等人构建的永生化猪单核细胞/巨噬细胞(Mingeun Sagong等人，Human telomerase reverse transcriptase-immortalized porcine monomyeloid celllines for the production of porcine reproductive and respiratory syndromevirus，Journal of Virological Methods 179(2012)26-32，以下称文献2)，然而上述文献1和文献2构建的永生化猪巨噬细胞均是适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的永生化细胞。由于PRRSV和ASFV是来源不同的两种病毒，虽然均可以在猪巨噬细胞中复制，但两者在基因组结构和感染机制上存在较大差别，例如ASFV的基因组是由长度为170～190kb的单分子线状双股DNA组成，而PRRSV的基因组为单股线性正链RNA，长度约为15kb；猪巨噬细胞的细胞表面糖蛋白CD163对于PRRSV感染细胞是必须的，而该糖蛋白CD163对于ASFV的感染可能是需要的，但不是必须的，提示其他巨噬细胞表面蛋白可能参与ASFV的感染过程。因此上述文献1和文献2公开的适用于培养PRRSV的永生化猪巨噬细胞并不适合用于培养ASFV，并且现有技术中还没有适用于体外培养ASFV的可靠、稳定且可连续传代的永生化猪巨噬细胞的报道。

发明内容