[发明专利]一种蒽醌类坏死探针靶向机制的研究方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于细胞及分子水平点击化学的后标记技术研究蒽醌类坏死探针作用机制的方法，利用后标记法对已在细胞内和靶点充分结合的蒽醌类探针进行荧光标记，结合荧光成像技术，找到蒽醌类坏死探针的靶细胞器甚至分子靶标，并进一步结合凝胶电泳及后标记技术，从而确定蒽醌类坏死探针的分子靶标。本发明还公开了坏死细胞暴露的DNA是蒽醌类坏死探针实现坏死靶向的重要靶标。该方法利用基于点击化学的后标记法，可以快速实现对蒽醌类坏死探针的细胞水平的靶标的标记及分子机制的研究。

技术领域

本发明属于化学生物学和分子探针技术领域，具体涉及基于点击化学的手段研究蒽醌类坏死探针的机制研究的方法。

背景技术

天然产物结构骨架独特又不失良好的生物相容性，一直以来是新药发现的重要来源。明确其体内作用靶点，有助于药理机制的阐明及毒副作用的发现，进而指导药物化学工作者在分子结构上进行针对性的优化改造，有利于提高药物的安全性及有效性。因此，对天然产物进行靶点鉴定是其研究过程中的关键环节。

本课题组前期研究发现，具有二蒽醌母核的金丝桃素(hypericin)能够特异性靶向坏死组织，是来源于天然产物的高效坏死组织显像剂。通过在该化合物上进行多种同位素标记，可以有效的对肿瘤坏死、心肌梗塞等坏死相关疾病进行成像。如，¹³¹I或⁶⁴Cu标记的hypericin，可对化疗药物(血管阻断剂，CA4P)治疗后的肿瘤坏死进行成像或者能够用于光动力消融肿瘤治疗效果的评价。随着对hypericin研究的不断深入，我们发现，蒽醌母核是其坏死靶向性的关键活性中心。我们对该类结构尝试了多方面的改造及筛选，发现同样是天然产物的单蒽醌化合物——大黄酸(rhein)，与hypericin相比，刚性减小，疏水性降低，具有更优的药代动力学性质，同时保持了较强的坏死靶向性。我们在大黄酸上标记¹³¹I或者^99mTc，成功应用于大鼠心梗模型上坏死心肌的成像，验证了其作为坏死探针的开发潜力。

但是，蒽醌类化合物坏死靶向机制研究不明确，直接限制了该类坏死探针的进一步开发。考虑到蒽醌是经典的DNA嵌入剂，而坏死组织暴露的DNA一直是坏死探针经典的靶点之一，已有多种以暴露DNA为靶点的坏死探针报道，如Hoechst-IR、Gd-TO等，同时我们在前期研究中也发现金丝桃素及大黄酸等蒽醌类坏死探针有较好的DNA结合能力。因此，我们假设大黄酸是通过与坏死细胞的DNA结合从而实现其坏死靶向性的，并在该项目中研究大黄酸的坏死靶向机制。

为了在细胞水平及分子水平研究蒽醌类化合物的坏死靶向机制，我们设计了基于点击化学或生物正交实验的后标记法对化合物进行荧光标记。点击化学又称“链接化学”或“动态组合化学”，旨在通过小单元的拼接，来快速、可靠地完成各种类型分子的化学合成，是近年来应用最为广泛、研究最为热门的基于活性蛋白质组分析的靶点鉴定策略之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于蒽醌类坏死探针机制不明确，提供一种基于点击化学的后标记方法。

通过激光共聚焦成像，研究化合物在细胞内的各个细胞器或亚细胞器的分布及定位是分子水平靶向机制研究的常用手段。这往往要求分子具有足够的荧光，以大黄酸类坏死探针举例，虽然大黄酸有一定的自身荧光，但是与DNA结合的分子，荧光往往会发生淬灭，影响观测。一般的解决方法是，将其他的荧光基团(如FITC)直接修饰到大黄酸上，从而考察其在坏死细胞中的分布，称为预标记。但是分子直接修饰荧光团的缺陷是，引入的荧光基团一般结构均较大，会对修饰后的分子性质产生较大影响，进而影响分子在细胞中的分布。因此，为了解决这一策略的不足，我们选择后标记的方法(图1)。