[发明专利]一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系及其应用

权利要求书

1.一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，包含引物探针混合物，其特征在于，所述引物探针混合物由四条检测EML4-ALK融合基因的特异性引物和三条检测EML4-ALK融合基因的特异性探针组成：

（1）所述特异性引物的序列，其特征在于：

ALK-DF1正向引物：5’-AACTACTGTAGAGCCCACACCT-3’，

ALK-DF2正向引物：5’-ACATCACACACCTTGACTGGTC-3’，

ALK-DF3正向引物：5’-GTTACCAAAACTGCAGACAAGCA-3’，

ALK-DR反向引物：5’-CTTGCTCAGCTTGTACTCAGGG-3’；

（2）所述特异性探针的序列，其特征在于：

ALK-DP1融合探针：5’-CCTAAAGTGTACCGCCGG-3’，

ALK-DP2融合探针：5’-TTGTACTTGTACCGCCGG-3’，

ALK-DP3融合探针：5’-AACCAAGTGTACCGCCGG-3’。

2.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述的四条检测EML4-ALK融合基因的特异性引物序列跨EML4-ALK融合基因的融合断点，正向引物和反向引物之间的待扩增区域包含EML4-ALK融合基因的融合断点。

3.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述的三条检测EML4-ALK融合基因的特异性探针5’端具有FAM荧光基团修饰，3’末端位修饰MGB非荧光淬灭基团。

4.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述的三条检测EML4-ALK融合基因的特异性探针序列跨EML4-ALK融合基因的融合断点。

5.根据权利要求1所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述反应体系由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、cDNA模板和去离子水组成。

6.根据权利要求5所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，其特征在于，所述引物探针混合物的浓度分别为：

ALK-DF1正向引物浓度为4.0-8.5 μmol/L；

ALK-DF2正向引物浓度为2.5-5.0μmol/L；

ALK-DF3正向引物浓度为3.5-6.5μmol/L；

ALK-DR反向引物浓度为5.5-10.0μmol/L；

ALK-DP1融合探针浓度为2.5-3.2μmol/L；

ALK-DP2融合探针浓度为2.1-3.0μmol/L；

ALK-DP3融合探针浓度为2.2-3.0μmol/L。

7.根据权利要求5或6所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系的应用，其特征在于，所述检测体系用于检测肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等样本中EML4-ALK基因融合变异。

8.根据权利要求7所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系的应用，其特征在于，检测肿瘤组织、外周血、血浆、外泌体等样本中EML4-ALK基因融合变异方法包括如下步骤：

提取样本中的RNA；

将上述提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA；

采用由10×引物探针混合物、dPCR-酶反应液、cDNA模板和去离子水组成的检测体系配制扩增反应；

按照如下扩增条件进行反应：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60-63℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温，反应结束；

通过数字PCR仪采集荧光信号，分析得到检测样本中EML4-ALK基因融合变异情况，给出判定结果。

9.根据权利要求8所述的基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系的应用，其特征在于，所述步骤（2）中RNA逆转录反应的参数为：

（1）变性反应：RNA样本在72℃变性3min，然后冰浴冷却；

（2）逆转录反应：48℃，60分钟；50℃，2分钟，48℃，2分钟，进行10个循环；70℃酶失活，15分钟；4℃保温，反应结束。