[发明专利]一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系及其应用

说明书

本发明提供了一种基于数字PCR检测EML4‑ALK融合基因的反应体系及其应用。所述检测体系包含EML4‑ALK融合基因的特异性引物和探针，通过筛选优化PCR扩增体系中引物探针序列和浓度比例组合，提高了融合突变的检出率，辅助特殊的RNA样本前处理过程，进一步减小了假阳性概率，同时使用数字PCR平台，显著提高了各种类型样本的检出率，本发明对游离核酸和外泌体RNA等微量样本的检测表现出较高的灵敏度和检测成功率。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系及其应用。

背景技术

随着生物分析技术的进步及信息化技术的发展，以及对基于基因医学理解的深入，精准医学（Precision Medicine）的概念从系统医学、转化医学等概念中提炼出来，成为一种高度综合且细致的医学新模式，有望提高疾病预防和疾病的治疗水平。随着世界许多主要国家提出精准医学的战略，精准医学已经成为未来医学的发展方向，2015年作为精准医学的元年，具有重要的历史意义，时至今日，精准医学已成不可以逆转的发展趋势。

EML4-ALK融合基因是在2007年由日本学者SODA等发现，研究表明不同的EML4-ALK融合基因亚型都具有恶性转化和致癌性能力。研究表明3%-13%的非小细胞肺癌患者含有此基因，它为非小细胞肺癌的个体化治疗提供了一个新的靶点。EML4-ALK融合基因几种常见亚型包括亚型1（49.6%）、亚型2（10%）、亚型3a和3b（25.6%）、亚型4、亚型5a和5b、亚型6和亚型7。EML4-ALK融合基因亚型1（E13;A20）由EML4第13外显子和ALK第20外显子融合而成；EML4-ALK融合基因亚型2（E20;A20）由EML4第20外显子和ALK第20外显子融合而成；EML4-ALK融合基因亚型3a（E6;A20）由EML4第6外显子和ALK第20外显子融合而成；EML4-ALK融合基因亚型3b（E6ins33;A20）由EML4第6外显子和ALK第20外显子融合而成 ,第6外显子中插入了一段33bp片段；EML4-ALK融合基因亚型4（E14;ins11del49A20）由EML4第14个外显子和ALK第20外显子融合而成，第20外显子中插入了一段11bp片段，删除了一段49bp片段；EML4-ALK融合基因亚型5a（E2;A2）0由EML4第2外显子和ALK第20外显子融合而成；EML4-ALK融合基因亚型5b（E2;ins117A20）由EML4第2外显子和ALK第20外显子融合而成，第20外显子插入了一段117bp片段；EML4-ALK融合基因亚型6（E3;ins69A20）由EML4第3外显子和ALK第20外显子融合而成，第20外显子插入了一段69bp片段；EML4-ALK融合基因亚型7（E14;del12A20）由EML4第14外显子和ALK第20外显子融合而成，第20外显子删除了一段12bp片段。

目前国内已上市了包括克挫替尼、塞瑞替尼、阿来替尼在内的多种ALK抑制剂，因此，提供一种灵敏度高、准确性高、步骤简单、成本较低的检测EML4-ALK融合基因的反应体系，在相关癌症的诊疗应用中具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种基于数字PCR检测EML4-ALK融合基因的反应体系，所述体系通过优化EML4-ALK融合基因的引物探针特异性，提高了融合突变的检出率，辅助特殊的RNA样本前处理过程，进一步减小了假阳性概率，综合上述特点及优势，本发明所述的检测体系可以在一个反应中实现三种EML4-ALK融合突变位点的同步检测，对于微量样本的检测具有巨大的应用价值，弥补了临床上取样困难、样本量少等不足。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：