[发明专利]Linc类HPV整合基因位点的筛选方法及应用

权利要求书

1.Linc类HPV整合基因位点的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提取人宫颈脱落细胞DNA；

S2、设计含有HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82这18种亚型的HPV全长探针；

根据Illumina的要求构建DNA测序文库，将样品基因组DNA酶切处理为若干DNA片段，然后将这些DNA片段进行末端修复和加A处理，构建的DNA文库总量≥1500ng，DNA文库的片段长度的主峰为350-550bp；

将18种亚型的HPV全长探针与基因组DNA文库进行杂交，捕获目标产物，洗脱未杂交的DNA片段；获取的DNA片段通过16轮PCR扩增，纯化后进行二次杂交捕获，获得的纯化后的扩增产物为测序文库，测序文库的浓度≥1ng/μL，测序文库片段长度的主峰为350-550bp；对测序文库进行测序；

S3、对步骤S2的测序结果进行分析；过滤、去除接头序列、低质量序列和重复序列，对过滤前后的序列质量进行评估，使过滤后的序列Q30＞80％，序列长度＞100bp；将经过预处理的测序数据，与HPV病毒和人类基因组参考序列进行比对，从中识别出若干部分比对上HPV基因组且部分比对上人类基因组的嵌合体序列；针对所述嵌合体序列，按照在人类基因组上的位置进行局部聚类，将局部聚类的序列与参考基因组进行局部比对，根据局部比对结果确定样品基因组是否在基因Linc02301、Linc01435、Linc00430、Linc00564中整合了HPV部分序列；

S4、利用常规PCR和Sanger测序验证HPV与宫颈癌发生相关的HPV整合基因位点Linc02301、Linc01435、Linc00430、Linc00564。

2.根据权利要求1所述的Linc类HPV整合基因位点的筛选方法，其特征在于，步骤S1中，人宫颈脱落细胞DNA的浓度＞15ng/μL，纯度A260/A280≥1.5，纯度A260/A230≥1。

3.根据权利要求1所述的Linc类HPV整合基因位点的筛选方法，其特征在于，步骤S2中，18种亚型的HPV全长探针与基因组DNA文库进行杂交的方式为：65℃杂交16-24h。

4.PCR扩增Linc类HPV整合基因位点的引物组合，其特征在于，Linc类HPV整合基因位点为Linc02301、Linc01435、Linc00430、Linc00564；

PCR扩增HPV整合基因位点Linc02301的上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示；

PCR扩增HPV整合基因位点Linc01435的上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8所示；

PCR扩增HPV整合基因位点Linc00430的上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10所示；

PCR扩增HPV整合基因位点Linc00564的上、下游引物序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12所示。

5.根据权利要求4所述的PCR扩增Linc类HPV整合基因位点的引物组合，其特征在于，HPV整合基因位点为Linc02301的整合序列如SEQ ID NO.1所示，HPV整合基因位点为Linc01435的整合序列如SEQ ID NO.2所示，HPV整合基因位点为Linc00430的整合序列如SEQ ID NO.3所示，HPV整合基因位点为Linc00564的整合序列如SEQ ID NO.4所示。

6.一种检测宫颈癌高危人群试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述的PCR扩增Linc类HPV整合基因位点的引物组合。

7.根据权利要求6所述的检测宫颈癌高危人群试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂、PCR试剂和若干样品保存管。