[发明专利]Linc类HPV整合基因位点的筛选方法及应用

说明书

本发明公开一种Linc类HPV整合基因位点的筛选方法及应用，属于生物诊断领域，通过针对HPV的整合位点Linc02301、Linc01435、Linc00430、Linc00564，设计相应的PCR扩增上、下游引物，并组装得到相应的检测宫颈癌高危人群的试剂盒，具有快速、方便、准确、假阳性率低等优点，创新好，对临床诊断有帮助。

技术领域

本发明属于生物诊断领域，特别是涉及宫颈癌相关的HPV整合基因位点的筛选方法及其应用。

背景技术

宫颈癌是指发生于子宫颈阴道和宫颈部的恶性肿瘤，是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌。我国宫颈癌在中国15-44岁女性各癌症发病率中居第二位，死亡率居第三位。研究表明，高危型HPV持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。分子生物学和细胞遗传学的进展证实，HPV与宿主染色体的整合才是宫颈细胞永生化过程中的重要步骤，是导致宫颈上皮内瘤变向宫颈癌恶性进展的一个重要标志。在90％以上的宫颈癌组织中均发现HPV与宿主细胞染色体的整合，HPV与宿主细胞基因组的整合是宫颈癌发展的最重要的危险因素。与此同时，国内外多个研究组在大样本的不同疾病状态(CIN1-3和宫颈癌)的人群中进行了HPV整合状态的检测，其结果表明病毒整合发生率与宫颈癌发病率成正相关，病毒整合状态与宫颈癌病情程度成正相关。因此，将HPV整合作为宫颈病变程度的标志物，对宫颈癌前病变和宫颈癌的早期辅助诊断具有非常重要的意义。

研究表明，HPV整合到人类基因组具有随机性。目前文献报道的HPV整合位点颇多，大量样本测序发现一些高频整合位点，例如POU5F1B、FHIT、KLF12等，这些高频位点对于癌症发生具有一定促进作用。但是，目前有研究表明长链非编码RNA(lincRNAs)在生物分子表观遗传调控中扮演着关键的角色，并参与癌症的发生、发展过程，当HPV整合到Linc基因家族上，对宫颈癌发生过程中起到相关调控作用，促进癌症的形成。因此，对HPV整合位点Linc类基因家族上研究具有重要的意义。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了针对Linc类HPV整合基因位点在宫颈癌高危人群检测方法，利用液相杂交捕获联合NGS测序法检测病毒整合和PCR Sanger测序法研究揭示了与宫颈癌发生相关的一类新的HPV整合基因位点Linc类基因家族(Linc02301、Linc01435、Linc00430、Linc00564)；根据HPV整合至上述位点，来制备检测宫颈癌高危人群的试剂盒。该试剂盒具有快速、方便、准确等优点，具体通过以下技术实现。

Linc类HPV整合基因位点的筛选方法，包括如下步骤：

S1、提取人宫颈脱落细胞DNA；一般可以选用若干LSIL患者的宫颈脱落细胞、HSIL患者的宫颈脱落细胞、宫颈癌患者的宫颈脱落细胞作为样本；LSIL是指低度鳞状上皮内病变，HSIL指高度鳞状上皮内病变，为宫颈上皮内瘤变的不同的病理分期；

S2、设计含有HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV82这18种亚型的HPV全长探针；

根据Illumina的要求构建DNA测序文库，将样品基因组DNA酶切处理为若干DNA片段，然后将这些DNA片段进行末端修复和加A处理，构建的DNA文库总量≥1500ng，DNA文库的片段长度的主峰为350-550bp；

(根据液相探针杂交捕获技术)将18种亚型的HPV全长探针与基因组DNA文库进行杂交，捕获目标产物，洗脱未杂交的DNA片段；获取的DNA片段通过16轮PCR扩增，纯化后进行二次杂交捕获，获得的纯化后的扩增产物为测序文库，测序文库的浓度≥1ng/μL，测序文库片段长度的主峰为350-550bp；对测序文库进行测序；