[发明专利]一种产酸菌JC-H及其应用与产酸菌JC-H的培养、鉴定方法

权利要求书

1.一种产酸菌JC-H，其特征在于，该菌株命名为：黑曲霉(Aspergillus niger)JC-H，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：21424。

2.根据权利要求1所述的产酸菌JC-H的培养方法，其特征在于，具体方法为：

步骤1、菌株的分离培养

采集受重金属污染严重的土壤作为样品；

制备查式培养基：将蔗糖30g、NaNO₃ 3g、K₂HPO₄ 1g、KCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂20g、蒸馏水1L，混合后，于121℃高温灭菌20min，接着倒平板待其凝固，制成无菌的查式培养基，用来进行分离培养；

将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养3-5d；

步骤2、鉴别产酸菌株

制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入查式固体培养基中，在121℃高温灭菌20min，倒平板待其凝固后制成无菌的鉴别培养基备用，其颜色为紫色；

将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落划线培养于产酸鉴别培养基；

培养3-5d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑取具有产酸能力的菌株多次划线于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株。

3.根据权利要求1所述的产酸菌JC-H在产酸中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用发酵培养基测定产酸菌JC-H的产酸效率，所述发酵培养基采用蔗糖100g，NaNO₃ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，KCl 0.025g，MgSO₄·7H₂O0.025g，酵母浸膏1.6g，调节pH为6，于121℃灭菌20min；

将产酸菌JC-H菌液按3.6×10⁶个/50ml的比例加入发酵培养基，于30℃、160rpm的转数下在恒温振荡培养箱中进行培养。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在发酵培养基中添加Zn²⁺浓度≤300mg/L，或Pb²⁺浓度≤2000mg/L时，或Cd²⁺浓度≤300mg/L对产酸菌JC-H的产酸效果基本无影响。

6.根据权利要求1所述的产酸菌JC-H的鉴定方法，其特征在于，包括：利用18S rRNA基因序列对菌种鉴定和发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定。

7.根据权利要求6所述的产酸菌JC-H的鉴定方法，其特征在于，利用18S rRNA对基因序列菌种鉴定具体为：

目标菌株18S rRNA基因序列的PCR扩增：

通过真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增。在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目标菌株的18S rRNA基因序列。

8.根据权利要求6所述的产酸菌的鉴定方法，其特征在于，发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定具体为：

首先进行0.1mol/LNaOH标准溶液、1％酚酞指示剂的配置；然后准确吸取10mL样品发酵液，转移到100mL容量瓶中，加蒸馏水至100mL刻度并摇匀；用滤纸过滤，准确吸取滤液20mL放入100mL三角瓶中，加入1％酚酞2滴，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至初显粉色在0.5min内不褪色为终点，记下NaOH用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗NaOH的含量。