[发明专利]一种乳粉加工环境中蜡样芽胞杆菌的溯源方法在审
| 申请号： | 202110774957.1 | 申请日： | 2021-07-07 |
| 公开（公告）号： | CN113564268A | 公开（公告）日： | 2021-10-29 |
| 发明（设计）人： | 姜毓君;杨鑫焱;宋丹靓敏 | 申请（专利权）人： | 东北农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/689 | 分类号： | C12Q1/689;C12Q1/6858;C12Q1/04;C12R1/085 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 王志新 |
| 地址： | 150030 黑*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 乳粉 加工 环境 中蜡样芽胞 杆菌 溯源 方法 | ||
1.一种乳粉加工环境中蜡样芽胞杆菌的溯源方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
(1)对婴幼儿配方乳粉原辅料、生产环境中和生产接触到的物质表面的细菌进行分离；
(2)对分离菌株进行DNA的提取；
(3)以步骤(2)获取的DNA为模板，利用通用引物FA-27F：5'-AGTCTCTGATCATGCCTCAG-3'和RA-1492R：5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'，进行16S rRNA序列的PCR扩增后鉴定蜡样芽胞杆菌；
(4)以步骤(2)获取的DNA为模板，利用引物panC-F引物为5'-TYGGTTTTGTYCCAACRATGG-3'和panC-R引物为5'-CATAATCTACAGTGCCTTTCG-3'进行panC基因的PCR扩增后鉴定蜡样芽胞杆菌；
(5)对分离菌株进行生理生化实验分析；
(6)以步骤(2)获取的DNA为模板，扩增持家基因并对蜡样芽胞杆菌进行分型；
(7)利用SPSS软件的相关性分析完成对婴幼儿配方乳粉中蜡样芽胞杆菌的进行溯源分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)按照TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒要求的具体方法对分离菌株进行DNA的提取。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增体系为：18μL 2×TaqPCR MasterMix，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，28μL ddH2O。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述生理生化实验分析为酪蛋白分解试验、溶血试验和蛋白质毒素结晶试验。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述持家基因为glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA和tpi；所述扩增glpF基因的引物为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；所述扩增gmk基因的引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；所述扩增ilvD基因的引物为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；所述扩增pta基因的引物为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；所述扩增pur基因的引物为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14；所述扩增pycA基因的引物为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:6；所述扩增tpi基因的引物为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述的基因分型的分析方法为：MLST数据库比对分析、蜡样芽孢杆菌的核酸多态性分析、系统发育分析和BURST分析。
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