[发明专利]一种从乌骨鸡组织中高效提取黑色素的方法

说明书

本发明公开了一种从乌骨鸡组织中高效提取黑色素的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将乌骨鸡皮肤、骨膜、肌肉等组织剥离、清洗、绞碎；(2)绞碎后进行酶解、离心得到沉淀物；(3)用2％TritonX‑100的PBS溶液和双蒸水反复冲洗、离心；(4)冷冻干燥，得黑色素。其中，所述酶解方法为先用木瓜蛋白酶进行消化，后用蛋白酶K进行二次消化。本发明相比于目前已公开的其他乌骨鸡黑色素提取方法在提取成本和提取纯度上大大优化，适用于大批量提取；纯度大幅提高；操作简单、安全、高效，并且不会破坏黑色素的形态和化学结构。

技术领域

本发明是属于生物天然产物提取技术领域，具体涉及一种从乌骨鸡皮肤与骨膜中提取黑色素的方法。

背景技术

乌骨鸡是我国畜禽基因库中具有特殊经济价值的珍禽，兼备药用、肉用，是我国闻名中外的药用家禽。乌骨鸡与其他品种最明显的区别就在于其身体多处呈乌黑色。乌骨鸡的药用价值在于其体内的黑色素，其可以吸收紫外辐射，清除自由基，具有抗氧化功能，从而可以延缓衰老、提高生物体免疫力。乌骨鸡黑色素不同于其他种类黑色素，如乌贼墨黑色素、芝麻黑色素等，是一类独特的复合种类黑色素，研究其结构及生化功能有助于开发乌骨鸡的食用、药用价值，有利于拓展乌骨鸡黑色素在保健品、化妆品、医学等领域的开发利用。由于乌骨鸡体内的黑色素与蛋白质等紧密结合，研究困难，因此开发一种高效提取乌骨鸡黑色素的方法非常重要

目前提取乌骨鸡黑色素的方法主要包括：酸解法，通过盐酸降解配合高温回流后快速冷冻的方法提取乌骨鸡黑色素，此法盐酸浓度过高，会对黑色素外部形态和内部化学结构造成破坏，从而影响生物学化性；酶解酸解混合法，采用“脱脂-酶解-酸解”三步法提取乌骨鸡黑色素，先用乙醇回流脱脂，后用蛋白酶进行酶解，酶解之后盐酸酸化，此法对对黑色素颗粒形态完整影响较小；酶解法，近几年，由于酶解法对黑色素的内部化学结构影响较小，酶解法逐步替代酸解法，酶解法主要包括：双酶水解法结合碱液去除蛋白法，酸性蛋白酶法，碱性蛋白酶法，木瓜蛋白酶法，蛋白酶K法等。酶解法有多种蛋白酶法，但不同酶法对黑色素提取的效果不同，提取时间、成本、提取率和提取纯度均有差异。

发明内容

为了优化现有技术中的流程，本发明提供一种用蛋白酶从乌骨鸡骨膜中提取黑色素的方法，该法能够有效地去除紧密结合在黑色素周围地蛋白质，并不会破坏黑色素的化学结构。

乌骨鸡黑色素是一类结构复杂且与蛋白质紧密结合的大分子多聚体，本发明的方法中用木瓜蛋白酶和蛋白酶K降解蛋白，通过2％TritonX-100的PBS溶液处理和双蒸水反复清洗，将黑色素从它的生理环境中释放出来。

一方面，本申请提供了一种从乌骨鸡组织中提取黑色素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将皮肤、骨膜、肌肉等组织剥离、清洗、绞碎；

(2)绞碎后进行酶解、高温灭酶、离心得沉淀物；

(3)清洗、离心、干燥得黑色素沉淀物；

其中，所述得酶解方法为先用木瓜蛋白酶消化，再用蛋白酶K进行二次消化。

进一步地，所述酶解为：将绞碎后的组织溶于PBS溶液中，先加入木瓜蛋白酶进行消化反应，后加入蛋白酶K溶液进行消化反应。

进一步地，所述酶解为利用5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液消化7-12h，后利用0.4-1mg/ml的蛋白酶K溶液进行消化4-8h。

进一步地，所述酶解为：将绞碎后的组织与溶液按质量体积比1：5g/ml加入PBS溶液中，加入木瓜蛋白酶，加入量按组织与木瓜蛋白酶质量比100：2.5-3，进行消化反应，消化反应结束后，离心取沉淀，加入PBS溶液中，加入的组织与PBS溶液按照质量与体积比约为1：100g/ml，后加入蛋白酶K，加入量按照组织与蛋白酶K质量比为100：4-10，然后进行第二次消化反应，反应后90℃高温处理，离心，清洗，离心。