[发明专利]用于结合磁珠并偶联转座酶的DNA接头、磁珠及DOT-seq方法

说明书

本发明公开了一种用于结合磁珠并偶联转座酶的DNA接头，所述接头为U形接头，接头的中间是寡聚单链核苷酸，且被修饰，以连接到磁珠上，寡聚单链核苷酸的两端分别带有双链Tn5识别序列，两端Tn5识别序列后面分别连接illumina测序文库结构的P5序列及P7序列。并公开了相应的新型磁珠及DOT‑seq方法。本发明的DOT‑seq使用了更加高效的磁珠偶联转座酶方法，能够有效保证转座酶二聚体中结合的接头是异质性接头，也能够保证转座酶在磁珠上的分布更加均匀化。DOT‑seq具有耗时更短、文库产量更高，对DNA质量和投入量要求更低和文库均一性更好等优点，适用于各类DNA NGS建库需求，尤其是低质量的病源DNA样本。

技术领域

本发明涉及一种用于结合磁珠并偶联转座酶的DNA接头、磁珠及DOT-seq方法，属于生物技术领域。

背景技术

DNA二代测序是现代病理学检测的主要手段，在疾病诊断、肿瘤筛查、病原鉴定和药物靶标设计等领域具有重要的作用。常规的DNA二代建库通常采用机械法或酶切法进行DNA片段化，再通过末端修复、接头连接和文库扩增一共四步完成DNA文库的构建。但是这种方法存在片段大小不均一、耗时长、对不同来源DNA片段化效果差异大，片段化效率不可控等因素，对于复杂病原样本经常会导致文库构建失败、产量低、均一性差等现象。随着转座酶的发现和改造，利用转座酶Tn5进行文库片段化和扩增的DNA NGS建库被研发出来并广泛使用，这种技术相较于传统的机械法和酶切法DNA建库相比，具有耗时短、操作简单的优势，但是对模板投入量的精准性具有严格的要求。通常而言，传统Tn5介导的DNA建库对DNA投入量及其敏感，投入量稍高会导致文库大片段严重，文库产量降低；投入量稍低会导致文库过小，产量降低。这些都是由于转座酶Tn5片段化后产生的DNA片段弥散严重导致的。这极大地降低了Tn5介导DNA文库构建的可操作性和应用范围。，且转座酶法建库产生的文库均一性要比传统机械法和酶切法要差很多。近年来，磁珠偶联转座酶法DNA建库技术被研发出来用于解决转座酶法建库带来的模板投入量要求严格和DNA文库均一性差等弊端，但是如何保证转座酶在磁珠上偶联均匀，且能够有效组装成转座酶异质性二聚体，一直没有有效的解决方案。这极大地限制了磁珠偶联转座酶法DNA建库技术的发展和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种磁珠偶联转座酶并用于DNA快速均一化建库方法（原理如图1），命名为DOT-seq(Dual On-bead Tagmentation and sequencing)。DOT-seq使用了更加高效的磁珠偶联转座酶方法，能够有效保证转座酶二聚体中结合的接头是异质性接头。

本发明采用的技术方案为：

一种用于结合磁珠并偶联转座酶的DNA接头，所述接头为U形接头，接头的中间序列为寡聚单链核苷酸，且被修饰，以连接到磁珠上，寡聚单链核苷酸的两端分别设有双链Tn5识别序列， 两端Tn5识别序列后面分别连接illumina测序文库结构的P5序列及P7序列。其中修饰位点通常位于寡聚单链核苷酸的1/3-2/3的区域，以保证两端的Tn5识别序列能够有充分的空间与Tn5结合，最优选的方案为寡聚单链核苷酸的中间位点。

优选的，U形接头中间的寡聚单链核苷酸被生物素修饰、氨基修饰或者Arcydite修饰。

优选的， U形接头中间的寡聚单链核苷酸长度为8-32 nt。

优选的，所述U形接头的序列为：[Phos]CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACT…T[Int NH2 C6 dT]T…TC GTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG，其中U形接头中间的寡聚单链核苷酸长度为8-32nt。

优选的，所述U形接头的序列为：[Phos]CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACT…T[Int Biotin dT]T…TC GTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGA CAG，其中U形接头中间的寡聚单链核苷酸长度为8-32 nt。