[发明专利]一种基于LAMP和自身猝灭荧光探针检测鲣鱼的引物组、方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于LAMP和自身猝灭荧光探针检测鲣鱼的引物组、方法和试剂盒，所述引物组包括一对外引物组，一对内引物组和一对环引物组；所述外引物组为F3和B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物组为FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物组为LF和LB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。本发明所提供的方法，其灵敏度可达5fg/μL。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，本发明涉及一种基于LAMP和自身猝灭荧光探针检测鲣鱼的引物组、方法和试剂盒。

背景技术

鲣鱼(Katsuwonus pelamis)，属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Pereiformes)、鲭科(Scombridae)，是一种重要的经济性海洋鱼类，是世界金枪鱼渔业捕捞对象之一。2018年，鲣鱼捕捞量为316万吨，占金枪鱼捕捞总量的56％以上。在我国，金枪鱼的消费量逐年递增，市售金枪鱼种类繁多，其市场价格也差异悬殊。然而，大多数金枪鱼被加工成冰鲜切片、罐头、鱼干等产品进行销售，而且产品包装缺乏正确的学名标注。消费者难以从外观上辨别出金枪鱼的真假和所属品种，由此造成了金枪鱼市场命名混乱，以次充好的复杂现状。2016年，安丽艳等在17个市售金枪鱼罐头中，发现58.8％来源于价格低廉的鲣鱼。因此，急需建立一些快速准确、简便实用的检测方法应用于市售鲣鱼成分的检测。

目前，鱼类的物种鉴定研究已逐渐从形态学转向分子生物学技术。以DNA为基础的分子检测技术由于具有较高的灵敏度和特异性，已广泛用于鱼类物种鉴定。近年来，核酸等温扩增技术在物种鉴定中发挥着重要作用。与PCR技术相比，等温核酸扩增反应是一种无需反复升降温，在同一温度下即可完成对靶标指数扩增的技术，其中，环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi于2000年开发的一种等温核酸扩增方法。该技术依赖于自动循环的链置换反应，通过设计4种特异性引物识别靶标DNA的6个区域，从而实现靶标DNA的扩增。Nagamine等于2002年又通过增加了2条环引物(LoopF，Loop B)对LAMP进一步改进，提高了LAMP的扩增效率。相较于其他等温扩增技术，LAMP是目前研究最多、最成熟的一种等温扩增技术，其具有快速检测、操作简单、高灵敏度、高特异性等优点，更适合现场实地检测。

通常，LAMP检测为终点检测，它需要对扩增后的产物进行测定，所以可能导致交叉污染或非特异性扩增。常见检测方法包括：琼脂糖凝胶电泳法，荧光目测比色法，实时浊度仪检测法。但这些方法都有一定的局限性，琼脂糖凝胶电泳中呈典型的梯状条带，只能判断是否发生扩增，但不能通过片段的大小来判断是否为非特异扩增，而且反应后开盖易造成气溶胶的污染；在扩增产物中加入荧光染料SYBR Green I，产物结合染料后发出绿色荧光，染料虽具有便捷、成本低、等优点，但在核酸拷贝数较低的情况下，指示剂从颜色中无法明显区分阳性和阴性样品，结果的判读标准受观察员主观判断影响较大；利用浊度仪检测LAMP反应中焦磷酸镁的沉淀，需大型仪器，成本昂贵，不适合现场检测。

非特异性检测方法的一个主要缺点是容易产生假阳性。尽管LAMP由4-6个不同的引物独立识别靶序列上的6-8个独立区域，在理论上比PCR具有更高的特异性。但是LAMP反应中使用的引物总浓度为3.6-4.4μM，，而在PCR反应中仅为0.4-1.0μM。其中LAMP的FIP和BIP引物长度为40-50bp，它们更容易形成引物二聚体或发夹结构，导致荧光染料与LAMP引物结合产生非特异性扩增。

基于碱基互补配对原则来识别特定核酸序列是特异性检测的一种有效方法，专利CN201510154708.7提供了一种基于LAMP和分子信标检测HPV16的方法，分子信标的设计需要在核酸两端分别标记荧光基团和淬灭基团，而分子信标的合成费用较高。使得检测成本增加。因此，本发明提供了一种基于LAMP和自身猝灭荧光探针检测鲣鱼的引物组、方法和试剂盒。

发明内容