[发明专利]一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，其核酸序列如下所示：

上游引物：GCTGTGGATTGGGAGAAATC(SEQ ID NO.1)；

下游引物：CAAGTTGACCAGCCTCTGC(SEQ ID NO.2)。

2.根据权利要求1所述的用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述绝对荧光定量PCR引物对是根据猪源胞内劳森菌aspA基因序列，通过引物设计软件设计，并进行验证获得。

3.一种用于检测胞内劳森菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物对。

4.一种检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述的引物对，进行荧光定量PCR检测。

5.根据权利要求4所述的检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，所述绝对荧光定量PCR方法包括以下步骤：

(1)提取胞内劳森菌感染猪回肠样品中的基因组DNA；

(2)利用权利要求1所述的引物对，PCR扩增aspA基因；

(3)利用步骤(2)扩增所得目的基因片段，构建重组阳性质粒aspA-pMD18-T/DH5α；

(4)以构建的aspA-pMD19-T/DH5α重组质粒作为阳性标准品，进行qPCR反应，制备标准曲线；

(5)提取待测样品基因组DNA，随后以其为模板进行qPCR反应，反应体系同步骤(4)，将得到的CT值代入步骤(4)所得标准曲线，从而计算出待测样品中胞内劳森菌的基因拷贝数。

6.根据权利要求5所述的检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(2)中，利用权利要求1所述的引物对PCR扩增aspA基因，反应体系包括：2×Taq Mix、ddH₂O、权利要求1所述引物对、DNA模板；反应程序为：92-98℃预变性4-6min，92-98℃变性25-35s，50-60℃退火25-30s，68-74℃延伸0.5-1.5min，共28-32个循环，68-74℃延伸8-12min。

7.根据权利要求5所述的检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(4)中，所述标准曲线的制备方法包括如下：

标准品的浓度可按下列公式折算为拷贝数：

提取阳性重组质粒aspA-pMD19-T/DH5α后测定浓度，换算成拷贝数，并10倍比连续稀释5个稀释倍数，作为标准阳性模板进行qPCR反应，反应结束后，以标准品的CT值为横坐标，标准品的拷贝数的Log值为纵坐标，进行线性拟合，绘制标准曲线。

8.根据权利要求5所述的检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，步骤(4)中，所述qPCR反应的反应体系包括：模板，权利要求1所述引物对，ROXReferenceDyeⅡ，2×SYBRGreenIMix，ddH₂O；程序包括：92-98℃预变性25-35s，92-98℃变性4-6s，55-65℃退火28-32s，反应程序共38-42个循环。