[发明专利]一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法，所述引物对包括上游引物和下游引物，其核酸序列如下所示：上游引物：GCTGTGGATTGGGAGAAATC(SEQ ID NO.1)；下游引物：CAAGTTGACCAGCCTCTGC(SEQ ID NO.2)。本发明还建立了一种胞内劳森菌绝对荧光定量PCR检测方法，该方法包括利用所述的引物对，进行荧光定量PCR检测。与传统方法相比，基于核酸特异性序列分子方法的实时荧光定量PCR具有快速、敏感、特异且稳定的优点。本发明可用于临床样品中低含量胞内劳森菌的快速和特异检测，可通过定量方法检测胞内劳森菌含量，从而为了解胞内劳森菌在猪体内的变化规律，以及为猪增生性回肠炎的诊断、流行病学调查及胞内劳森菌致病机制研究奠定基础。

技术领域

本发明属于胞内劳森菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法。

背景技术

猪回肠炎，又称猪增生性回肠炎(porcine proliferative enteritis，PPE)，是由胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis，L.intracellularis)感染引起的一种接触性肠道传染病，主要影响猪群生长速度，给养猪业带来严重经济损失，已成为现代养猪业中一种重要的肠道疾病。PPE在欧洲和美国等地发病率可达50％-70％，在韩国、泰国、马来西亚等国家，PPE阳性率达100％，仅美国养猪业一年因PPE造成的损失就不低于2000万美元，英国一年因PPE损失约400万英镑。在欧洲，由于抗生素和添加剂明令禁止使用，使得当地回肠炎的危害性已大大超过了呼吸道疾病。从2005年来，PPE已成为中国华南、华东地区规模化养猪场的一种常见病，检测结果表明，3-4周龄和8-10周龄猪群PPE阳性率一般低于50％，而从18-24周龄PPE阳性率高达50％-70％，后备母猪和经产母猪阳性率分别为60％-80％。由于抗生素的滥用，使得细菌产生耐药性，这将对PPE的防控构成严重威胁。

高效、简便的检测技术是有效防治养殖场传染病的必要条件，一种能够快速、准确、定量的检测样品中胞内劳森菌的检测方法将对该病的诊断及防控带来重大意义。对于PPE的诊断，国际普遍使用的诊断方法主要分为特异性诊断和非特异性诊断两大类。其中，以组织病理学诊断为主的非特异性诊断方法有Warthin-Staixy银染技术、苏木素－伊红染色(HE)、Ziehl-Neelsen法等；特异性的诊断方法包括血清学、分子生物学和组织学的诊断，包括间接免疫荧光光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化(IHC)、原位杂交(ISH)等技术。目前，中国国内主要是通过常规PCR、多重PCR等分子生物学方法间接地检测样品中LI的核酸。常规的聚合酶链式反应(PCR)通过目的基因的扩增可使用少量的样品得到准确可靠的结果，具有操作简便、设备要求不高、反应迅速且能进行大批量检测的优点，成为了现代养猪业中检测胞内劳森菌的常用方法，，但由于该方法灵敏性低，无法对临床样品中的细菌进行定量等缺点，从而无法真实反应猪群的感染情况，鉴于此，建立一种准确、可靠、可定量的检测临床样品中胞内劳森菌的检测方法对于PPE的有效防控具有重要意义。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对、试剂盒及检测方法，为PPE的诊断、流行病学调查及胞内劳森菌的定量检测等工作奠定基础。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种用于检测胞内劳森菌的绝对荧光定量PCR引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下所示：

上游引物：GCTGTGGATTGGGAGAAATC(SEQ ID NO.1)；

下游引物：CAAGTTGACCAGCCTCTGC(SEQ ID NO.2)。

所述绝对荧光定量PCR引物对是根据猪源胞内劳森菌aspA基因序列，通过引物设计软件设计，并进行验证获得。