[发明专利]原矛头蝮蛇毒C型蛋白的制备方法及其作为诊断试剂的应用

权利要求书

1.原矛头蝮蛇毒C型蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、分子筛凝胶过滤层析；

Sephadex G-75凝胶层析柱2.6×100cm，用PBS(磷酸盐缓冲生理盐水，含0.147mol/LNaCl的0.01mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH7.4)平衡，流速24ml·h^-1；称取原矛头蝮蛇毒冻干粉0.5g，溶于3ml PBS，将溶解后的蛇毒溶液以2000rpm离心10min，取上清液上样于前述已用PBS平衡好的Sephadex G-75凝胶柱。上样完毕后，以PBS进行洗脱，流速24ml·h^-1，自动收集器收集洗脱液，4ml/管，测定280nm吸光值，取标记的洗脱部分合并用于下一步分离纯化。

步骤二、肝素亲和层析；

取原矛头蝮蛇毒Sephadex G-75层析活性峰，脱盐或稀释后，上样于肝素亲和层析柱，采用PB缓冲液(0.01mol·L-1 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH7.0)平衡肝素亲和层析，用含NaCl的PB缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml·min-1，2ml/管收集样品，测定280nm吸光值，收集活性峰；

步骤三、阳离子交换层析；

HiTrap SP阳离子交换预装柱采用PB(0.01mol·L-1 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH7.0)为平衡，取肝素亲和层析获得的活性峰上样后，充分洗脱后，用含1mol NaCl的PB缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml·min-1，收集活性峰，SDS-PAGE检测纯度，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量后，放入-80℃超低温冰箱备用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三可以替换为：

步骤三、凝胶过滤层析

取肝素亲和层析获得的活性峰冻干粉溶于1.5mlPBS中，以2000rpm离心10min，取上清液上样于Sephacrycl S-100凝胶层析柱(1.0×70cm)，用PBS缓冲液洗脱，流速30ml/h，2ml/管收集样品，A₂₈₀nm测其吸光值。收集活性峰，SDS-PAGE检测纯度，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量后，放入-80℃超低温冰箱备用。

3.权利要求1或2方法制备的原矛头蝮蛇毒C型蛋白，其特征在于，所述原矛头蝮蛇毒C型蛋白：12％SDS-PAGE测定目标蛋白在还原与非还原条件下的分子量，工作电压为160V，电泳后采用考马斯亮蓝R-250染色；标准蛋白质marker分子量是磷酸酶b-97.2kDa、牛血清蛋白-66.4kDa、卵清蛋白-44.3kDa、碳酸苷酶-29.0kDa、胰蛋白酶抑制剂-20.1kDa、溶菌酶-14.3kDa；采用Sephacrycl S-100凝胶1.0cm×60cm，进行分子量测定，采用四种标准蛋白：Albumin-67.0kDa，Ovalbumin-43.0kDa，Chymotrypsinogen A-25.0kDa，Ribonuclease A-13.7kDa；MALDI/TOF测定目标蛋白的精确分子质量；

等电聚焦测定变性条件下目标蛋白的等电点，两性电解质Ampholine的pH范围为3.5-10，电泳后的凝胶采用KCl浸泡法测定pH梯度。

4.根据权利要求3所述原矛头蝮蛇毒C型蛋白作为诊断血友病以及与GPIb结构与功能异常的血小板相关疾病的试剂盒的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：原矛头蝮蛇毒C型蛋白能通过作用vWF进而通过GPIb激活血小板导致血小板聚集，使其可以用于检测vWF的功能及血小板的聚集功能。