[发明专利]原矛头蝮蛇毒C型蛋白的制备方法及其作为诊断试剂的应用

说明书

本发明原矛头蝮蛇毒C型蛋白的制备方法及其作为诊断试剂的应用，通过三步层析从国产原矛头蝮蛇毒中分离纯化得到新颖的目标蛋白Protocetin，其具有诱导血小板发生聚集的功能。基于Protocetin能通过作用vWF进而通过GPIb激活血小板导致血小板聚集，使其可以用于检测vWF的功能及血小板的聚集功能，从而能在临床上用于检测血友病以及与GPIb结构与功能异常的血小板相关疾病。

技术领域

本发明涉及原矛头蝮蛇毒及其应用领域，特别涉及原矛头蝮蛇毒C型蛋白的制备方法及其作为诊断试剂的应用。

背景技术

蛇毒是自然界中高度复杂的活性蛋白与肽的混合物，是有毒蛇类捕食和防御的重要物质基础，也是各种重要蛋白酶、新药及诊断试剂研发的重要资源库。原矛头蝮(Protobothrops mucrosquamatus)蛇毒含有大量作用于血液凝固系统的活性蛋白，其中C-型凝集素样蛋白具有特异性高活性强的特点，在抗凝新药及血液凝血功能诊断试剂的研发中有重要的应用前景。

本发明涉及从原矛头蝮蛇毒中分离纯化得到的一个新颖的C-型凝集素样蛋白及其作为检测假性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)和血小板聚集功能检测试剂的应用。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供原矛头蝮蛇毒C型的制备及作为诊断试剂的应用

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

原矛头蝮蛇毒C型的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、分子筛凝胶过滤层析；

Sephadex G-75凝胶层析柱2.6×100cm，用PBS(磷酸盐缓冲生理盐水，含0.147mol/LNaCl的0.01mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH7.4)平衡，流速24ml·h^-1；称取原矛头蝮蛇毒冻干粉0.5g，溶于3ml PBS，将溶解后的蛇毒溶液以2000rpm离心10min，取上清液上样于前述已用PBS平衡好的Sephadex G-75凝胶柱。上样完毕后，以PBS进行洗脱，流速24ml·h^-1，自动收集器收集洗脱液，4ml/管，测定280nm吸光值，取标记的洗脱部分合并用于下一步分离纯化。

步骤二、肝素亲和层析；

取原矛头蝮蛇毒Sephadex G-75层析活性峰，脱盐或稀释后，上样于肝素亲和层析柱，采用PB缓冲液(0.01mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH7.0)平衡肝素亲和层析，用含NaCl的PB缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml·min-1，2ml/管收集样品，测定280nm吸光值，收集活性峰；

步骤三、阳离子交换层析；

HiTrap SP阳离子交换预装柱采用PB(0.01mol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH7.0)为平衡，取肝素亲和层析获得的活性峰上样后，充分洗脱后，用含1mol NaCl的PB缓冲液进行梯度洗脱，流速为1ml·min-1，收集活性峰，SDS-PAGE检测纯度，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量后，放入-80℃超低温冰箱备用。

进一步的，所述步骤三可以替换为：

步骤三、凝胶过滤层析

取肝素亲和层析获得的活性峰冻干粉溶于1.5ml PBS中，以2000rpm离心10min，取上清液上样于Sephacrycl S-100凝胶层析柱(1.0×70cm)，用PBS缓冲液洗脱，流速30ml/h，2ml/管收集样品，A₂₈₀nm测其吸光值。收集活性峰，SDS-PAGE检测纯度，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质定量后，放入-80℃超低温冰箱备用。