[发明专利]一种体外NK细胞的扩增方法及其NK细胞

权利要求书

1.一种体外NK细胞的扩增方法，其特征在于，从血液中分离提取单个核细胞，采用含偶联蛋白磁性微球的培养基对提取的单个核细胞进行扩增培养，获得NK细胞；其中，所述偶联蛋白磁性微球上偶联有IL15、IL18、CD86、CD137L和MICA蛋白，五种蛋白的质量比为1:1:1:1:1；

采用含偶联蛋白磁性微球的培养基对分离的单个核细胞进行扩增培养的具体操作为：

（1）将提取的单个核细胞接种至含偶联蛋白磁性微球的培养基的培养瓶中，培养4-5天，培养过程通过向培养瓶中补加含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基，控制细胞密度为6×10⁵/mL～1×10⁶/mL；其中，含偶联蛋白磁性微球的培养基是将自体血浆、偶联蛋白磁性微球悬浮液、IL-2加入到GT-T551无血清培养基中，混合均匀得到的；

（2）在培养的第6-7天，向培养瓶中补加含偶联蛋白磁性微球的培养基继续进行培养，培养过程控制细胞密度为8×10⁵/mL～1×10⁶/mL；

（3）在培养的第8-11天，补加含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基继续进行培养，培养过程控制细胞浓度在1×10⁶/mL～2×10⁶/mL；

（4）培养至第14-18天，收集培养的NK细胞。

2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，偶联蛋白磁性微球悬浮液的制备方法包括以下步骤：

（S1）采用结合缓冲液对His-tag蛋白纯化磁珠进行洗涤，洗涤后收集磁珠，得到预处理His-tag蛋白纯化磁珠；

（S2）将带有His标签的蛋白重悬于结合缓冲液中，得到蛋白溶液，然后将蛋白溶液与步骤（S1）得到的预处理His-tag蛋白纯化磁珠进行混合反应，反应后进行磁性分离，去上清，得到偶联蛋白磁性微球；其中，所述蛋白为IL15、IL18、CD86、CD137L和MICA蛋白；

（S3）采用洗涤缓冲液对步骤（S2）得到的偶联蛋白磁性微球进行洗涤，然后将洗涤后的偶联蛋白磁性微球重悬于洗涤缓冲液中，即得偶联蛋白磁性微球悬浮液，其中，每毫升偶联蛋白磁性微球悬浮液中含有20～80mg的偶联蛋白磁性微球。

3.根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，每毫升偶联蛋白磁性微球悬浮液中，每种带His标签蛋白的含量为0.5-1mg。

4.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤（1）中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中偶联蛋白磁性微球的数量与接种的单个核细胞数量相同；步骤（2）中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中偶联蛋白磁性微球的数量与补加培养基前培养瓶中的细胞数量相同。

5.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤（1）中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为2.5%-10%，IL-2的浓度为200U/mL；含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为2.5%-10%，IL-2的浓度为200U/mL；步骤（2）中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为1%-5%，IL-2的浓度为200U/mL；步骤（3）中，含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为1%～5%，IL-2的浓度为200U/mL。

6.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，步骤（S1）中His-tag蛋白纯化磁珠的材质为聚苯乙烯微球、聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球、聚苯乙烯-镍微球中的任意一种。

7.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，His-tag蛋白纯化磁珠的尺寸为100nm～50μm。