[发明专利]一种体外NK细胞的扩增方法及其NK细胞

说明书

本发明属于细胞培养技术领域，具体公开了一种体外NK细胞的扩增方法及其NK细胞，所述体外NK细胞的扩增方法为从外周血或脐带血中分离提取单个核细胞，采用含有偶联蛋白磁性微球的培养基对提取的单个核细胞进行扩增培养，获得NK细胞；其中，所述偶联蛋白磁性微球上偶联有IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA中的至少一种。本发明将NK细胞生长所需的多个激活及扩增信号蛋白分子偶联到磁性微球表面，使用偶联蛋白磁性微球进行NK细胞的体外扩增培养，能够显著提高不同来源单个核细胞中NK细胞的扩增效率及纯度的稳定性，而且扩增得到的NK细胞具有较强的杀伤能力；并且能够通过简单的物理分离方法将外源性的磁珠微球从培养体系中全部移除，有利于细胞药物质量的控制。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种体外NK细胞的扩增方法及其NK细胞。

背景技术

NK细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞。与T细胞介导的免疫监视应答体系所不同的是，NK细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。

获得足够数量，足够纯度的NK细胞是开展NK细胞药物研发的基础。目前NK细胞大规模扩增工艺主要有两条技术路径：

1、在培养基里添加多种细胞因子如：IL2、IL15、IL18等，刺激NK细胞活化信号通路，对NK细胞进行扩增与激活。但这种方式存在的问题是由于不同来源的血液样本中NK细胞含量不一，扩增潜能各异，导致扩增效率和扩增纯度呈现比较大的差异，无法满足细胞药物开发中批件次均一性的要求。

2、还有一种方法是用采用滋养层(feed layer)细胞作为核心原材料来进行NK细胞扩增，其大致工艺为用K562细胞(一种B细胞来源的白血病细胞系)，用基因工程改造的方式把能特异性扩增激活NK细胞的细胞因子如IL21等跨膜表达在K562细胞膜表面，将基因工程改造的K562细胞系通过放射源辐射照射灭活后，按照一定比例加入到NK细胞培养体系中，NK细胞能够以工程化K562细胞为核心聚团生长，K562细胞表达的跨膜细胞因子能够持续作用于NK细胞表面相应的受体，传递激活信号。采用这种方法进行扩增的NK细胞具有扩增效率及扩增纯度高的优势，但是由于其采用的支持物是肿瘤细胞系，虽然经过了辐照灭活，但不可避免的会在终产物中产生残留，给后续的临床研究及药物注册申报带来巨大的障碍。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种体外NK细胞的扩增方法及其NK细胞。

基于上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种体外NK细胞的扩增方法，从血液中分离提取单个核细胞，采用含偶联蛋白磁性微球的培养基对提取的单个核细胞进行扩增培养，获得NK细胞；其中，所述偶联蛋白磁性微球上偶联有IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白中的至少一种。

根据上述的扩增方法，优选地，采用含偶联蛋白磁性微球的培养基对分离的单个核细胞进行扩增培养的具体操作为：

(1)将提取的单个核细胞接种至含偶联蛋白磁性微球的培养基的培养瓶中，培养4-5天，培养过程通过向培养瓶中补加含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基，控制细胞密度为6×10⁵/mL～1×10⁶/mL；其中，含偶联蛋白磁性微球的培养基是将自体血浆、偶联蛋白磁性微球悬浮液、IL-2加入到GT-T551无血清培养基中，混合均匀得到的；

(2)在培养的第6-7天，向培养瓶中补加含偶联蛋白磁性微球的培养基继续进行培养，培养过程控制细胞密度为8×10⁵/mL～1×10⁶/mL；