[发明专利]UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法

权利要求书

1.一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：混标的制备：

按比例称取槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素、山奈酚后将八种黄酮类化合物粉末充分混匀，制得粉末混合物，称取适量粉末混合物后使用纯甲醇对其定容，得到混标；

步骤二：样品预处理：

S1：对冷冻的尿液进行解冻后，取适量尿液置于塑料Ep管，低温离心得到上清液A，取上清液A备用；

S2：在上清液A中分别加入混标、30-70ul的浓度为2mol/L的乙酸钠缓冲盐、5-20ul的β-葡萄糖醛酸苷酶和芳基硫酸酯酶的混合酶，其中β-葡萄糖醛酸苷酶:15.2U/ml、芳基硫酸酯酶:23U/ml，恒温水浴加热1-3h，得到水浴孵化好的样品；

S3：向水浴孵化好的样品中加入1ml纯乙腈，低温离心后得到上清液B；

S4：将上清液B移至西林瓶中，并在西林瓶瓶口包裹保鲜膜，低温冷冻，得到冷冻样品；

S5：在西林瓶瓶口的保鲜膜上扎至少一个小孔，将西林瓶连通冷冻样品置于冷冻干燥机中低温干燥15-30小时后取出；

S6：在干燥后的西林瓶内加入150-300ul纯甲醇后在涡旋仪上进行复溶，得到复溶样品；

S7：将复溶的样品移至塑料Ep管中，低温离心得到上清液C；

S8：将上清液C移至尼龙微孔滤膜中过滤至进样瓶中进UPLC-MS中检测分析；

步骤三：检测方法的液质条件为：

一、色谱条件：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；

色谱柱型号：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，所述色谱柱的规格为100mm×2.1mm，1.8μm；采用梯度洗脱的方式；流速为0.2mL/min，柱温为25℃，进样体积为5μL，流动

相梯度洗脱参数为：

二、质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV；离子源温度为120℃；去溶剂温度为350℃，雾化气流速为500L/h，锥孔气流速为50L/h；同时监测各目标物。

2.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述步骤一中，槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素、山奈酚的比例为(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100):(1.000-1.100)。

3.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述步骤一中，混标定容后的最终浓度为1000ng/mL。

4.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述S1中，尿液的解冻前的冷冻温度为-80℃，尿液的解冻温度为1-6℃，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。

5.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述S2中恒温水浴加热的温度为30-40℃。

6.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述S3中，低温离心的温度为1-6℃，低温离心的转速为8000-12000rrp，低温离心时间8-15min。

7.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，其特征在于：所述S6中，涡旋仪进行涡旋复溶的时长为20-45s。