[发明专利]UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法

说明书

本发明公开了UPLC‑MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，即槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素和山奈酚的检测，先利用超高效液相色谱将待测物与尿液基质分离，再利用质谱定量法，以标准品的浓度为X轴，以标准品中定量离子峰面积为Y轴，建立标准曲线，计算上述8种黄酮类化合物的浓度。本发明釆用冷冻干燥机对样品进行浓缩处理，复溶后进超高效液相色谱‑串联质谱联用仪(UPLC‑MS)分析，冷冻干燥机通过预冻样品中的水分及有机溶剂，在真空状态下直接升华，可利用冷阱捕获蒸发出来的气体，使蒸发过程快速进行，使用24小时冷冻干燥代替氮吹可简化样品前处理步骤，提高检测效率，适合大样本检测人体尿液中黄酮类化合物。

技术领域

本发明涉及生物监测领域，具体是一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法。

背景技术

近年来，果蔬的健康促进效益日益受到国内外学者的关注。大量流行病学调查资料显示，水果蔬菜的摄入能够有效调节血糖、血脂代谢，降低2型糖尿病、代谢综合征、脑卒中等慢性病的发病风险。目前果蔬摄入常用的评价工具是膳食频率问卷(FFQ)，这种半定量的问卷由于自我报告摄入量不精确且难以控制回忆偏倚，因此反映机体果蔬摄入量最好结合生物标志物检测。大量研究表明，尿液中黄酮类化合物能够作为果蔬摄入的生物标志物，客观反应人体果蔬摄入情况，有助于研究果蔬摄入与疾病的关联。

黄酮类化合物(flavonoids，简称FVD)广泛存在于水果、蔬菜、牧草和药用植物中，是植物在长期的自然选择中产生的一些次级代谢产物，许多植物的叶、皮、根和果实中都含有一定量的FVD，具有抗氧化作用、抗炎、预防癌症等活性。然而大多数FVD还没有被开发为预防或治疗疾病的化学药物，主要与其在体内的生物利用度低有关，未吸收的FVD能够通过尿液排出。机体摄入富含黄酮类化合物的食物后经过代谢最终能够通过超高效液相色谱-串联质谱联用(UPLC-MS)在尿液中检测到。根据文献报道，目前使用UPLC-MS法检测尿液中FVD时采用的预处理方法主要通过氮吹浓缩样本，通过氮吹仪将氮气吹入样本的表面，使样本中的溶剂快速蒸发、分离，经过无氧浓缩后得到较纯净的样本。但是对于存放时间较长、尿液中FVD含量较低的样本，甚至需要氮吹两次进行浓缩，不但增加了工作量，还进一步放大了氮吹的缺陷。使用氮吹仪进行氮吹主要有以下缺点：

第一，使用氮吹仪进行氮吹时存在将样品中物质吹到实验室中的风险，必须在通风橱中操作；

第二，氮吹可燃溶剂存在爆炸危险，因此对于含有可燃溶剂的样本无法使用氮吹进行浓缩；

第三，浓缩有毒溶剂时，即使将整个系统置于通风柜中，操作者仍然存在中毒风险；

第四，氮吹时样品温度高，不适用于温度敏感性样品；

第五，氮吹仪的孔数与气针数量有限，常见的氮吹仪主要为12孔、24孔和36孔，样品处理量少，无法一次大批量处理样本；

第六，氮吹过程中需要保持氮气体流量恒定、均匀，因此操作者需要根据样品液面不断调节气流，对全过程进行监控；如果未能控制好气流，容易造成样本喷溅，既损失样本，还易造成样本相互污染；

第七，氮吹需要消耗氮气，增加额外成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种UPLC-MS/MS法检测人体尿液中8种黄酮类化合物浓度的方法，包括以下步骤：

步骤一：混标的制备：

按比例称取槲皮素、橙皮素、杨梅素、柚皮素、根皮素、异鼠李素、芹菜素、山奈酚后将八种黄酮类化合物粉末充分混匀，制得粉末混合物，称取适量粉末混合物后使用纯甲醇对其定容，得到混标；