[发明专利]一种能够在烟草中进行高效基因编辑的载体及其应用有效
申请号: | 202110786304.5 | 申请日: | 2021-07-12 |
公开(公告)号: | CN113667689B | 公开(公告)日: | 2023-04-11 |
发明(设计)人: | 代常波;吕婧;孙玉合;李冰洁;王李先秋 | 申请(专利权)人: | 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) |
主分类号: | C12N15/82 | 分类号: | C12N15/82;C12N15/84;C12N15/55;C12N15/113 |
代理公司: | 北京英创嘉友知识产权代理事务所(普通合伙) 11447 | 代理人: | 耿超 |
地址: | 266101 山东*** | 国省代码: | 山东;37 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 能够 烟草 进行 高效 基因 编辑 载体 及其 应用 | ||
本公开涉及一种能够在烟草中进行高效基因编辑的载体,所述载体中依次插入有35Spro启动子、gRNA插入区、eu终止子、钙网蛋白启动子元件、spCas9蛋白表达元件、ubp终止子和潮霉素筛选标记。所述载体为pDC45载体系统,其能显著提升烟草的基因编辑效率,并且能够大大提高多靶点、纯合/双等位的编辑效率,为高通量创制植物全基因组编辑株系奠定基础。
技术领域
本公开涉及基因工程领域,具体地,涉及一种能够在烟草中进行高效基因编辑的载体及其应用。
背景技术
基因组编辑技术是一类对物种基因组进行定向改变的现代生物技术,因其具有修饰效率高、特异性强、无物种限制等特点,得到了广泛的关注和应用。最早开发利用的基因编辑技术是锌指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALEN),虽然能实现不同物种的基因组修饰,但存在设计复杂、工作量大、效率低、费用昂贵等缺点。CRISPR-Cas技术是最新的3代基因编辑技术,由成簇且有规律间隔的回文重复序列和CRISPR核酸酶蛋白Cas构成,是古细菌在进化中形成的一种获得性自我免疫防御体系(Ishino Y,1987)。CRISPR-Cas系统因其设计操纵简便、编辑高效、精确与没有物种特异性等优势而被广泛应用于动、植物及微生物基因功能解析、新种质创制及遗传改良。
近年来,利用II型CRISPR-Cas9系统,在水稻、玉米、拟南芥、西红柿等植物中实现了基因组定向编辑。尽管科学家在小麦、烟草等多倍体植物中也实现的基因编辑,但由于多倍体植物必须,必须同时敲出1个基因的多个拷贝才能实现该基因在特定发育过程中作用,比如,同时敲除小麦A、B和D基因组的MLO基因才能获得小麦抗白粉病的特性(Wang el al,2014,Nature biotech)。烟草是多倍体研究的重要模式植物,在代谢、抗体生产、外源蛋白表达等方面具有重要的作用。2015年,Gao等人首次在栽培烟草中实现了基因编辑,在NtCCD8、NtPDS和NtPDR6基因实现了77.8%、81.8%和87.5%的突变效率,双等位突变效率分别为16.7%、36.4%和6.25%(Gao,et al,2015,2018)。烟草多基因编辑方面,Jansing等(Jansing et al,2018)靶向4个本氏烟a-1,3-fucose基因获得了10%-14%的编辑效率,靶向β-1,2-xylose时获得了62-67%的编辑效率。谢小东等(2019)利用5个u6-26启动子串联同时敲除5个基因,单基因切割效率在76.9-92.3%,同时编辑的效率仅为53.8%,但纯合/双等位编辑效率未检测。
传统基因编辑载体,实现10-85%左右的单倍体基因编辑效率,但纯合或双等位编辑仅为6.3-36.4%。同时,由于基因功能的冗余性,对于多倍体植物来说,常常需要同时编辑一个同源基因及基因家族,才能获得需要的发育表型,因此存在着多倍体植物编辑效率低的缺陷。
发明内容
本公开的目的是提高多倍体植物编辑效率。
本发明的发明人出乎意料地发现:在同一载体中,使用35Spro启动子驱动gRNA,并且使用钙网蛋白启动子元件驱动spCas9蛋白,能够大幅度地提高多倍体植物编辑效率,由此得到本发明。
因此,为了实现上述目的,本公开第一方面提供一种能够在烟草中进行高效基因编辑的载体,所述载体中依次插入有35Spro启动子、gRNA插入区、eu终止子、钙网蛋白启动子元件、spCas9蛋白表达元件、ubp终止子和潮霉素筛选标记,所述钙网蛋白启动子元件的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
优选地,所述35Spro启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.10;所述gRNA插入区的核苷酸序列为SEQ ID NO.11;所述eu终止子的核苷酸序列为SEQ ID NO.12;所述spCas9蛋白表达元件的核苷酸序列为SEQ ID NO.13;所述ubp终止子的核苷酸序列为SEQ ID NO.14;所述潮霉素筛选标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.15。
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