[发明专利]三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂及其检测方法在审
| 申请号： | 202110788280.7 | 申请日： | 2021-07-13 |
| 公开（公告）号： | CN113528706A | 公开（公告）日： | 2021-10-22 |
| 发明（设计）人： | 陈剑峰;陈慧;沈琴文;王涵宇;孔令洁;隋礼丽 | 申请（专利权）人： | 苏州博腾生物制药有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93 |
| 代理公司： | 苏州新知行知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 32414 | 代理人： | 郑丽玲 |
| 地址： | 215000 江苏省苏州市苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 通道 双淬灭 探针 检测 复制 病毒 试剂 及其 方法 | ||
1.一种三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂，其特征在于：其包括第一引物探针对、第二引物探针对和第三引物探针对，第一引物探针对为VSV-G引物和探针对，VSV-G正向引物的基因为SEQ ID NO：1，反向引物的基因为SEQ ID NO：2，对应的探针的基因为SEQID NO：3；第二引物探针对为gag引物探针对，gag正向引物的基因为SEQ ID NO：4，反向引物的基因为SEQ ID NO：5，对应的探针的基因为SEQ ID NO：6；第三引物探针对为RPP30引物探针对，RPP30正向引物的基因为SEQ ID NO：7，反向引物的基因为SEQ ID NO：8，对应的探针的基因为SEQ ID NO：9。
2.根据权利要求1所述的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂，其特征在于：所述的探针均为双淬灭探针，在双淬灭探针的 5'核酸酶水解探针的基础上，除了在探针的3'端设有普通淬灭基团，还在探针中间额外设有中间淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂，其特征在于：所述的中间淬灭基团为ZEN淬灭基团、TAO 淬灭基团、DUQ淬灭基团或DBQ淬灭基团中的一种。
4.根据权利要求1所述的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂，其特征在于：所述的三种引物探针对的浓度分别为第一引物探针对200nM～400nM，第二引物探针对200nM～400nM，第三引物探针对200nM～400nM。
5.一种利用权利要求1-4中任意一项的试剂的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的检测方法，其特征在于：其包括以下步骤：
S1细胞培养，具体为：将慢病毒感染293T细胞，并至少培养5代；
S2准备待测的样品，具体为：利用DNA提取试剂盒提取样品；
S3标准品稀释，制备标准曲线样品；
S4根据所要检测的标准曲线、空白对照及待测样品数量，确定所需的反应孔数；
S5根据所需反应孔数，配制相应量的qPCR反应液与引物探针的混合液，震荡离心后备用，各试剂置于冰上融化，轻微振荡混合均匀；
S6每个反应孔中添加相应量的qPCR反应液与引物探针的混合液，再按要求在不同的反应孔中分别添加标准品、稀释液、阴性质控NCS、待测样品和样品ERC；
S7控制各个反应孔的反应过程，先进行UNG酶温浴，然后激活聚合酶，PCR循环若干个循环，然后进行DNA变性处理，再进行退火和延伸处理；
S8、将标准品浓度输入到分析软件中，根据标准曲线，软件自动输出每个样品的Ct值及三个靶标的浓度。
6.根据权利要求5所述的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的检测方法，其特征在于：所述的步骤S4中，计算反应孔数量的方法为：反应孔数=（6个浓度梯度的标准曲线+ 1个无模板对照NTC + 1个阴性质控NCS+待测样品数×2）×3。
7.根据权利要求5所述的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的检测方法，其特征在于：所述的步骤S5中，qPCR反应液与引物探针的混合液中包括AceQ U+ Universal ProbeMaster Mix预混液、VSV-G/gag/RPP30-F、VSV-G/gag/RPP30-R和VSV-G/gag/RPP30-P。
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