[发明专利]三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂及其检测方法

说明书

本发明公开了一种三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂，其包括第一引物探针对、第二引物探针对和第三引物探针对，第一引物探针对为VSV‑G引物和探针对；第二引物探针对为gag引物探针对；第三引物探针对为RPP30引物探针对。本发明还公开了可复制性慢病毒的检测方法，步骤为：S1细胞培养；S2准备待测样品；S3制备标准曲线样品；S4确定所需的反应孔数；S5配制所需的qPCR反应液与引物探针的混合液；S6按要求在反应孔中添加混合液以及标准品、稀释液、阴性质控NCS、待测样品和样品ERC；S7控制各个反应孔的反应过程；S8用分析软件得到每个样品的Ct值及三个靶标的浓度。本发明能降低背景信号值，提高最终信号值，检测灵敏度高，更有利于低浓度的检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒（RCL）的试剂及其检测方法。

背景技术

随着CAR-T（嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）细胞药物的迅速发展，在CAR-T的生产过程中，常用慢病毒载体将嵌合基因高效地导入T细胞中，尽管慢病毒载体具有复制缺陷，但如果在慢病毒生产过程中发生穿梭质粒、包装质粒和T细胞之间或慢病毒载体与T细胞的内源性逆转录元件之间发生同源或非同源重组，则可能导致复制型慢病毒（RCL）的潜在风险。

FDA建议的检测方法包括：1)检测RCL相关蛋白；2)实时定量qPCR方法检测样本中RCL特异性DNA序列。而标准的检测RCL的细胞共培养方法周期较长，约需6周或者更长时间才能获得实验结果。

TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。FDA现允许用TaqMan探针即水解探针(hydrolysisprobes)qPCR方法快速检测产品RCL情况。

现有技术中，公开号为CN110117675A的专利，公开了一种实时荧光定量PCR检测RCL的试剂和方法，公开了试剂组合包括特异性扩增VSV-G基因的第一引物和第一探针，所述的第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，特异性扩增VSV-G基因的第二引物对和第二探针，第二引物对包括第二上游引物和第二下游引物，特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，第三引物对包括第三上游引物和第三下游引物。内参基因的内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。因而，这篇文件中，实质上是采用了两组特异性扩增VSV-G基因的引物探针对。该对比文件还公开了RCL的检测方法，该方法为：提供一待测DNA样品，利用前述的试剂组合，对待测DNA样品进行实时荧光定量PCR；计算待测DNA样品的Cq值和VSV-G基因拷贝数，从而判断样品中是否含有RCL。所述方法为TaqMan探针法。在同一扩增体系中，利用特异性扩增VSV-G基因的第一引物对和第一探针以及特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，对待测DNA样品进行实时荧光定量PCR。

分析可知，上述的专利文献中，实时荧光定量PCR检测RCL的试剂和方法，虽然设置了三对引物和探针，但是第一对引物和探针以及第二对引物和探针都是特异性扩增VSV-G基因的引物探针对，第三对引物和探针是特异性扩增内参基因，这三对引物和探针的设置，实质上是单通道检测方法，存在扩增效率低，特异性不好，准确度不高等问题。

发明内容

本发明的目的在于针对背景技术中所述的现有的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂及其检测方法，扩增效率低，特异性不好，准确度不高等问题，提供一种能够解决前述问题的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂及其检测方法。