[发明专利]一种DENV-4全长感染性克隆及其构建方法

权利要求书

1.一种DENV-4全长感染性克隆，其特征在于，所述DENV-4全长感染性克隆的序列为SEQID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的全长感染性克隆，其特征在于，所述全长感染性克隆的构建方法如下：

(1)将病毒cDNA分为三个片段进行PCR，PCR 1：1-3384bp，PCR 2：3385-6987bp，PCR 3：6988-10470bp，PCR产物加A尾后连接至T载体上，分别对应的克隆质粒为pT-DV4-1、pT-DV4-2、pT-DV4-3；

(2)在公司合成了DENV-4H241经典毒株3’UTR：10566-10664bp，经双酶切后，T4连接酶连接至经双酶切的pT-DV4-3载体上，得到克隆质粒pT-DV4-3-3UTR，至此，我们获得了基因组前后分别加入了DENV-4H241经典毒株的5’UTR：1-36bp和3’UTR：10566-10664bp的毒株全长序列；

(3)构建全长感染性克隆：使用的载体是pTight载体，载体上包含了pBR322来源的高拷贝复制原点、七次四环素应答元件、巨细胞病毒真核启动子、丁型肝炎病毒核酶的反基因组序列和猴病毒40聚腺苷酸化信号序列、氨苄青霉素抗性等元件，使用的感受态细胞是C41；克隆方法具体步骤是：将PCR1的片段和PCR2的片段通过融合PCR融合为片段A，pT-DV4-3-3UTR上基因组的序列为片段B，通过同源重组的方式先将片段A和片段B重组到线性化的载体pTight上，最终得到了基因组全长的克隆pZG14D4。

3.权利要求1所述的全长感染性克隆制备出的重组病毒。

4.权利要求1所述的全长感染性克隆在制备具有遗传稳定性的登革病毒中的应用。

5.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备研究登革热、登革出血热或登革休克综合征药物中的应用。

6.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备抗登革病毒药物中的应用。

7.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备研究登革病毒抗原表位中的应用。

8.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求3所述的重组病毒在制备疫苗方面的应用。