[发明专利]一种DENV-4全长感染性克隆及其构建方法

说明书

本发明构建了登革病毒血清4型(DENV‑4)全长感染性克隆pZG14D4。本发明使用真核转录载体pTight，通过在启动子前加入7xTRE四环素应答元件以降低蛋白在细菌中的渗漏表达的方法，构建出了DENV‑4感染性克隆pZG14D4。该系统能成功且高效地拯救出活病毒，在转染后第二天即可观察到病毒阳性的细胞，第五天上清中病毒的滴度可达到10⁶FFU/ml。在细菌中连续传代五次的基因组cDNA克隆经测序无碱基突变亦无杂峰，转染进Huh7.5细胞，仍能产生高滴度的病毒(10⁵FFU/ml)，说明该质粒能在细菌内稳定复制，具有遗传稳定性。拯救出的子代病毒与亲代病毒在体外的增殖的生长曲线相当。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种DENV-4全长感染性克隆及其构建方法。

背景技术

登革病毒(DENV)感染引起的一系列疾病是目前热带地区重要的蚊传播病毒性疾病，传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊。1970年以前，9个国家有过严重的登革热流行，而目前登革已经影响到热带和亚热带地区的100多个国家，每年约有3.9亿登革热感染病例发生，约70％的病例出现在亚洲。世界卫生组织估计，在过去50年中观察到的全球发病率增加了30倍。如今，登革病毒对全球公众健康构成重大威胁，全球约有五分之二的人口处于受登革感染的风险之中。

在全球范围内，登革病毒有四种血清型(DENV-1，DENV-2，DENV-3和 DENV-4)，可引起登革热(DF)、登革出血热(DHF)以及登革休克综合征(DSS)。登革热是一种急性发热性疾病，伴有头痛，眶后疼痛，肌痛，关节痛，皮疹，出血症状和/或白细胞减少症。DHF的标志性特征包括血小板减少症，出血和血浆渗漏征象，这可能导致低血压性休克(DSS)。尽管感染后机体可保持数十年的针对该血清型的保护性免疫，但继发感染不同的血清型则会增加患重症的风险，重症登革热如果不加以治疗，死亡率可达20％。目前尚无特异性抗病毒治疗药物，有几种在局部国家或地区使用或处于临床试验的疫苗，但是由于登革的抗体依赖性增强(Antibody-Dependent Enhancement，ADE)的现象给疫苗的研发与推广带来了巨大的挑战。

登革病毒是单股正链RNA包膜黄病毒，其10.7kb基因组含有5'、3'UTR和一个开放阅读框，其编码一条多聚蛋白，该多聚蛋白被宿主和病毒蛋白酶翻译后切割成三种结构蛋白(C，capsid；pr/M，膜蛋白；E，包膜蛋白)和七种非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5)。

反向遗传系统是从病毒基因组的分子水平研究病毒生活史，以及发病机制、研发疫苗和开发抗病毒药物的重要方式。对于RNA病毒，我们常通过建立其全长感染性克隆和复制子来对其进行体外研究。HCV DAA药物的研发和上市是 HCV复制子系统应用于抗病毒药物筛选的一个典型案例。

将黄病毒基因组RNA转染至细胞系产生了感染性的病毒颗粒，这一现象促进了黄病毒反向遗传学的发展。但是困扰人们构建黄病毒基因组以及其他病毒的cDNA克隆的一大难题是，包含病毒全长或者部分序列的质粒在转化细菌内容易出现片段丢失、重组，以及对细菌产生毒性等问题，导致我们不能得到稳定的克隆。因此，人们想了一系列办法，包括避开细菌扩增途径：在酵母中重组得到克隆；用长片段PCR得到全长基因组，再体外转录出RNA转染至细胞；用CPEC反应(环状聚合酶延伸克隆技术)得到含全长基因组和真核启动子的质粒，再转染至细胞；用Gibson反应得到含全长基因组和真核启动子的质粒，再转染至细胞；用ISA反应(感染性亚基因组扩增子)得到含全长基因组和真核启动子及3’UTR末端元件的几个互相重叠的PCR片段，再转染至细胞等方法。在细菌中扩增的方法有：预测基因组序列在大肠杆菌中可能成为启动子的序列加以修改，降低其可能性以稳定基因组；在ZIKV NS1序列中插入在真核生物内能剪切去除的内含子；在真核启动子前加入7XTRE四环素应答元件以降低蛋白在细菌中的渗漏表达等方法。

发明内容