[发明专利]一种用于副百日咳鲍特菌检测探针、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明提供了一种用于副百日咳鲍特菌检测探针、试剂盒及其使用方法。该试剂盒为基于MIRA荧光法的副百日咳鲍特菌核酸检测试剂盒。其中，MIRA的引物是根据副百日咳杆菌的特异插入重复序列IS1001序列设计的，本发明提供了一种快速、特异、灵敏、无需复杂仪器设备的核酸检测试剂盒及其使用方法。

技术领域

本发明属于分子诊断生物学技术领域，涉及一种用于副百日咳鲍特菌检测探针、试剂盒及其使用方法。

背景技术

鲍特菌属(Bordetella)是一类革兰氏阴性杆菌，目前该属包括10个种，其中百日咳鲍特菌(B.pertussis)、副百日咳鲍特菌(B.parapertussis)、霍氏鲍特菌(B.holmessi)和支气管败血鲍特菌(B.bronchiseptica)与人类呼吸道感染相关。前三者的唯一宿主为人类。百日咳鲍特菌是人类百日咳感染的主要致病菌，常感染未进行接种的婴幼儿。副百日咳鲍特菌通常引起较轻微的百日咳样症状，并且持续时间较短。霍氏鲍特菌是与人类百日咳感染有关的最新鲍特菌物种，青少年和成年人感染率更高。支气管败血鲍特菌可感染多种哺乳动物，引起人类咳嗽的情况较罕见，主要发生在患有免疫缺陷疾病的人群，如艾滋病患者。无细胞百日咳疫苗对副百日咳鲍特菌和霍氏鲍特菌的感染几乎没有保护作用，几种鲍特菌对不同抗菌药物的敏感性也有所差异。因此，准确鉴定和区分鲍特菌的种类对于确定和优化治疗方案以及抑制病原菌的传播具有重要意义。

近年来，分子生物学方法不断被应用到呼吸道病原体的快速检测中，呼吸道病原体的实验室诊断方法取得了很大的进展，核酸检测已经成为了呼吸道病原体实验室诊断的发展方向。相对于传统的实验室检测法，分子诊断技术具有无可比拟的检测速度、特异性和灵敏度，已成为实验室诊断的新标准。

MIRA(Multienzyme Isothermal Rapid Amplification)技术是一种多酶恒温核酸快速扩增技术，基本原理是：在常温恒温下，重组酶和引物形成蛋白/单链核苷酸的复合体Rec/ssDNA，在辅助蛋白和单链结合蛋白SSB的帮助下，侵入双链DNA模板；在侵入位点形成D-loop区域，并开始对DNA双链进行扫描；待找到与引物互补的目的区域后，复合体Rec/ssDNA解体的同时，聚合酶也结合到引物的3’末端，开始链的延伸，这个过程迅速高效地循环，从而完成目的片段超快速扩增。荧光检测则依赖核酸外切酶的作用，加入根据模版设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备实现对目标片段扩增过程的实时监控。MIRA技术具有快速、简便、无需特殊仪器等优点，目前已被应用于多种重要疾病病原体的检测中。

针对现有技术中存在的问题，本发明研发并评估了多酶快速恒温扩增荧光MIRA法作为副百日咳鲍特菌核酸检测的试剂盒。

发明内容

因此，本发明为了解决上述技术问题中的至少一个，提供了一种用于副百日咳鲍特菌检测探针、试剂盒及其使用方法，该试剂盒能够节约反应时间，反应温度要求低。

根据本公开的第一方面，提供了一种引物组合，用于扩增包括副百日咳鲍特菌基因序列的扩增片段，其特征在于，所述引物组合包括第一引物和第二引物，其中，

所述第一引物的序列为：

CAGCCCACAGGCGGAGATCGTCTATGACTT；

所述第二引物的序列为：

GGACATAGACCGTCAGCAGCGGCTGGTTGG。

在一些可能的实现方式中，还包括第三引物，所述第三引物的序列为：

TCCATGTCGTGGCCAAGTATGGACGAGAGGTCATTGATCGGGTGCGCGTG。

根据本公开的第二方面，提供了一种探针组合，用于副百日咳鲍特菌的核酸检测，包括所述第一引物、第二引物和荧光探针；所述荧光探针为经过位点修饰后的所述第三引物。