[发明专利]一种通过槟榔碱与脯氨酸含量检测槟榔幼苗干旱状态的方法

权利要求书

1.一种通过槟榔碱与脯氨酸含量检测槟榔幼苗干旱状态的方法，其特征在于，所述通过槟榔碱与脯氨酸含量检测槟榔幼苗干旱状态的方法包括：

步骤一，槟榔幼苗干旱处理：将槟榔幼苗栽种于塑料盆中，放置在光照培养箱内，进行适应性培养，不浇水处理，持续干旱多天；

步骤二，样品的采集：分别在处理后不同天数后收集槟榔叶片和根系样品，液氮速冻后存于冰箱储存；

步骤三，槟榔碱含量的测定：使用间接ELISA法对槟榔碱含量进行测定；

步骤四，脯氨酸含量的测定：使用水浴浸提法对脯氨酸含量进行测定；

步骤五，槟榔幼苗干旱状态的判断：通过测定槟榔碱含量与脯氨酸含量的比值来判断槟榔幼苗的干旱状态。

2.如权利要求1所述的通过槟榔碱与脯氨酸含量检测槟榔幼苗干旱状态的方法，其特征在于，步骤一中，选取长势一致的1-2叶龄槟榔幼苗，所述槟榔幼苗每周浇一次1/2Hoagland营养液，所述Hoagland营养液的pH＝6.0。

3.如权利要求1所述的通过槟榔碱与脯氨酸含量检测槟榔幼苗干旱状态的方法，其特征在于，所述光照培养箱的温度为26℃，光照时间为：光16h/暗8h。

4.如权利要求1所述的通过槟榔碱与脯氨酸含量检测槟榔幼苗干旱状态的方法，其特征在于，步骤三中，所述使用间接ELISA法对槟榔碱含量进行测定，包括：

(1)样品提取液的准备；

(2)包被：将96孔酶标板中各孔加入12mL包被缓冲液，置于37℃孵育3h或置于4℃冰箱孵育，弃液，用洗涤液冲洗酶标板3次；

(3)封闭：将酶标板中各孔加入150μL封闭液，置于37℃孵育30min；

(4)标品、样品及抗体的准备：分别配置6000ng/mL、2000ng/mL、666.7ng/mL、222.2ng/mL、74.1ng/mL、24.7ng/mL、8.23ng/mL的槟榔碱标品；将样品提取液分别用样品稀释液稀释1500倍；将抗体用样品稀释液稀释；

(5)加样孵育：将标品及样品的稀释液分别以50μL/孔加到酶标板对应孔中；置于37℃孵育30min；弃液，用洗涤液冲洗酶标板3次；

(6)加二抗：将辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体稀释1000倍；以100μL/孔加到酶标板对应孔中；弃液，用洗涤液冲洗酶标板4-6次；

(7)显色：准备底物显色液，将底物显色液以100μL/孔加到酶标板对应孔中，常温显色20min；

(8)终止反应：将终止液以50μL/孔加到酶标板对应孔中；

(9)观察结果：用酶联免疫检测仪在490nm下测定吸光值。

5.如权利要求4所述的通过槟榔碱与脯氨酸含量检测槟榔幼苗干旱状态的方法，其特征在于，所述样品提取液的准备，包括：

①称取槟榔样品粉末50mg；

②加入1mL浓度为50％甲醇，所述甲醇为用去离子水稀释色谱级无水甲醇；

③超声处理30min-1h；

④-20℃静置3-5h；

⑤室温涡旋混匀；

⑥10000g离心10min，取上清；

⑦使用1mL一次性使用无菌注射器吸取(4)中溶液，用0.45μm有机相针式滤器过滤。

6.如权利要求4所述的通过槟榔碱与脯氨酸含量检测槟榔幼苗干旱状态的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述包被缓冲液加入3μL包被抗原。

7.如权利要求1所述的通过槟榔碱与脯氨酸含量检测槟榔幼苗干旱状态的方法，其特征在于，步骤四中，所述使用水浴浸提法对脯氨酸含量进行测定，包括：

(1)标准曲线的制作；

(2)样品脯氨酸的提取：分别称取槟榔幼苗叶片和根系各阶段的0.1g样品，至2.0mL的离心管中，各加1mL 3％的磺基水杨酸溶液，90℃水浴振荡10-15min；室温12000g离心10min；取上清，过滤备用；

(3)样品中脯氨酸的测定：每种样品的滤液都设置三个重复。