[发明专利]一种树突状细胞靶向抗肝癌脂质体疫苗的制备方法和应用

权利要求书

1.一种树突状细胞靶向载肝癌细胞总mRNA免疫脂质体疫苗的制备方法和应用，其特征在于可以高效靶向树突状细胞表面DEC205受体，促进免疫原性物质呈递，其制备方法步骤为：

（1）RNA抗原提取与纯化：

选取对数生长状态的患者肝癌细胞，加入1mL的Trizol裂解细胞并转移到无RNA酶的EP管中；

静置5-10min后，4℃条件12000g离心10分钟；将1mL上清转入另一EP管中，室温静置5min；

加入200μL氯仿并强烈振动15秒，彻底将两相混合，室温静置3min；后在4℃条件下，12000g速度离心15min；小心吸取200μL上层水相（RNA），转移到另一个1.5mLEP管中；

加入200uL异丙醇，缓缓倒置混匀，室温静置10min，再以12000g速度离心10min后，吸去上清，加入1mL预冷的75%乙醇，温和倒置，洗涤沉淀；再以7500g速度离心5min；

小心吸去上清，底部沉淀经室温干燥白色沉淀至透明后；加入适量DEPC处理水；用紫外分光光度计分别测定样品在OD260/280nm波长上的光密度，检测获得肝癌细胞总mRNA的浓度；-80℃保存备用；

（2）树突细胞靶向载总肝癌mRNA脂质体的制备：

将1体积质量比1:1~5:0.1的胆固醇、DOTAP、DSPE-PEG-COOH溶解于氯仿溶液中，45℃条件下真空旋转蒸发30min，生成匀称的脂质层膜；

将10体积的PBS缓冲液震荡重悬脂质层膜，所得悬液分别通过200nm、100nm、50nm聚碳酸酯膜挤出，各15次，制得阳离子脂质体；

将（1）收集的总mRNA与（2）中脂质体按照质量比1：10~25共混过夜，获得载肝癌总mRNA阳离子脂质体；

向上述载肝癌总mRNA阳离子脂质体中加入磷酸盐缓冲液调节PH至5~6后，加入10nM的EDCS（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）孵育6小时，再加入DEC205靶向核酸适体过夜，经过凝胶层析柱分离除去游离状态的适体分子，制得树突细胞靶向载肝癌总mRNA免疫脂质体。

2.根据权利要求1中所述树突状细胞靶向载肝癌细胞总mRNA免疫脂质体疫苗，其特征在于，组成包括DEC205靶向适体、免疫原性物质、阳离子脂质、PEG化磷脂及胆固醇。

3.根据权利要求2中所述DEC205靶向适体，其特征在于适体核酸序列具体为GGGAGGUGUGUUAGCACACGAUUCAUAAUCAGCUACCCUCCC。

4.根据权利要求2中所述免疫原性物质，其具体为肝癌细胞所提取的总mRNA。

5.根据权利要求2中所述阳离子脂质，其具体为DOTAP（（2,3-二油酰基-丙基）-三甲胺）。

6.根据权利要求2中所述PEG化磷脂，其具体为DSPE-PEG-COOH（二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基）。

7.根据权利要求1中所述一种树突状细胞靶向载肝癌细胞总mRNA免疫脂质体疫苗，其应用为肝癌免疫性治疗制剂，即可高效靶向树突状细胞表面DEC205受体，增强抗原呈递以诱导T细胞产生强烈的免疫应答，进而抑制肝癌细胞的生长。