[发明专利]一种树突状细胞靶向抗肝癌脂质体疫苗的制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种树突状细胞靶向载mRNA脂质体肝癌疫苗，载肝癌细胞总mRNA的纳米脂质体肿瘤疫苗，能高效靶向树突状细胞表面DEC205受体并被树突状细胞吞噬内化，其携带的肝癌mRNA在树突状细胞内翻译合成为肝癌抗原，并通过内源性抗原呈递给CD8阳性T细胞，或通过交叉提呈途径呈递给CD4阳性T细胞，诱发高效的抗肝癌细胞免疫应答，达到杀伤肝癌细胞，有效抑制肝癌的效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于肝癌免疫治疗的RNA脂质体疫苗制剂，具体为一种肝癌总mRNA（抗原）与靶向阳离子脂质体组合肝癌疫苗及其制备和应用。

背景技术

肝癌是世界范围内常见的肿瘤之一，复发转移率高，预后较差[Journal ofImmunology, 2001, 166(5): 2953-2960]。传统疗法在肝细胞癌中的疗效十分有限，特别是对于晚期和难治性癌症[Leukemia, 2020, 1763-1775]。通过对抗肿瘤免疫力和肿瘤微环境的深入了解，新型的免疫疗法已用于癌症治疗中[Cancer Medicine, 2020, 9(9):2943-2959]。

肝癌疫苗是利用肿瘤细胞和正常细胞表达蛋白的差异，有效地递呈肿瘤抗原来致敏特异性细胞毒性T淋巴细胞，因此特异性更高，副作用相对更小。肝癌细胞mRNA脂质体（阳离子脂质体）疫苗是指将编码肿瘤抗原的肝癌细胞RNA包裹入脂质纳米颗粒中，这些脂质纳米颗粒可以靶向树突状细胞，诱导产生高效的抗肝癌细胞特异性免疫应答，抑制肿瘤生长。纳米脂质体除了可以包裹各种抗原，还可以负载免疫佐剂，同时具有组织相容性和无免疫原性的特性，因此它可以作为一种优良的疫苗载体用于肿瘤免疫治疗[Advanced DrugDelivry Review, 2016, 99(PtA): 85-96]。

DEC-205是C型凝集素巨噬细跑甘露糖受体家族成员，其在淋巴结T细胞区树突细胞上特异性高表达。由于巨噬细胞胞浆区含有介导内吞和靶向晚期内涵体/MHCⅡ室的蛋白基序，使得DEC205能更高效地将抗原加载到MHCⅡ分子上并提呈给T淋巴细胞，有研究表面，DEC205受体提呈效率可高于甘露糖受体100倍。目前国外研究者将抗原（如HIVp24 Bag、Ova、HEL）与DEC-205单抗交联后实现抗原靶向。

适体（aptamer）是用配体指数富集法系统演化（SELEX）技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的，能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列。其与靶分子的结合和抗原-抗体作用相似，适体具有明显优于抗体的许多特性。此外，DEC205靶向适体具有靶分子范围广、与配体作用亲和力高特异性强、高度稳定性、安全经济等优点。

发明内容

本发明的目的是制备一种靶向树突状细胞的抗肝癌的RNA脂质体疫苗，具体为一种树突状细胞高效提呈的载肝癌细胞全mRNA的脂质体疫苗制剂。该RNA脂质体疫苗易于树突状细胞提呈并被其翻译合成肿瘤抗原，诱导高效的抗肝癌细胞特异性免疫应答，杀伤肝癌细胞。本发明新型RNA脂质体疫苗可用于肝癌的个体免疫治疗，具有抗原提呈效率高、毒副作用低的优势。

本发明提供一种树突状细胞靶向载肝癌细胞总mRNA免疫脂质体疫苗的制备方法，其特征在于可以高效靶向树突状细胞表面DEC205受体，促进免疫原性物质呈递，其制备方法步骤具体包括：

（1）RNA抗原提取与纯化：