[发明专利]一种提高克氏原螯虾抗病能力的SNP分子标记及应用

权利要求书

1.一种筛选克氏原螯虾优良抗病能力SNP基因型的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(1)分别提取每个个体克氏原螯虾的血淋巴RNA，具体步骤如下所述：

使用1ml注射器从克氏原螯虾虾体内抽取390-400μl血液样品，按体积比为1：1与ACD抗凝剂，其配方为0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖，溶于100ml双蒸水；混合至400μl，置于EP管中，并置于冰上；在800×g，4℃，离心20min离心，分离血细胞；弃上清，保留白色沉淀，加入预冷的Trizol试剂200μl，使用研磨器研磨至白色沉淀消失，使Trizol溶液呈粉色，每个样品再次加入800μl Trizol试剂；在室温下静置5min，然后在4℃，12000×g离心10min；取上清900μl置于新的EP管中，加入200μl氯仿，在振荡条件下充分混匀，不要涡旋震荡，前后晃动15s左右，室温下静置5min；在4℃，12000×g，离心10min；离心后溶液呈现三层，用枪头置于液面以下小心吸取上层清液400μl；加入等量异丙醇至400μl，轻柔混匀，在室温下静置5min；在4℃，12000×g，离心15min，直到观察到白色沉淀；去上清，不要吸走沉淀，若无沉淀留少量溶液，加入DEPC水配置的1ml 75％浓度的乙醇，重悬；在4℃，8000×g，离心5min，去上清；吸干溶液，将EP管置于通风橱内晾干2-5min；

(2)使用反转录试剂盒反转录得到cDNA，具体步骤为：

将8μl RNA溶液，2μl 5×FastKing-RT SuperMix，加10μl ddH2O混合于PCR管中，放入PCR仪，于42℃15min，随后95℃，3min；

(3)设计引物：根据NCBI核酸数据库数据，利用Primer5软件设计引物：

Cru-F：5‘-GGGGACACACATCCTGAGGACC-3’，

Cru-R：5‘-TGAACA AGCGAGCCAACAACC-3’；以及

ALF-F：5‘-ATGCAGCCGTGCCAGGCTCAGGT-3’，

ALF-R：5‘-CTATTGCTTGAGCCAAGCT-3’；

(4)对不同克氏原螯虾个体的cDNA样本进行PCR检测，具体步骤如下：

利用正向引物Cru-F，反向引物Cru-R，正向引物ALF-F和反向引物ALF-R扩增目的片段，利用琼脂糖凝胶电泳检测片段完整性；PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；于4℃保存；

(5)将PCR产物送测序公司进行测序，根据测序公司返回的具体序列信息后，利用软件Sequencher比对各个个体间抗病基因的序列差异，筛选得到SNP位点；

(6)参与检测的克氏原螯虾个体数量为176尾，其中雌性克氏原螯虾75尾，雄性克氏原螯虾101尾，经检测确定抗病基因ALF共有4个SNP位点，共2种基因型；经检测确定抗病基因Crustin共有5个SNP位点，10种基因型，其中四种基因型基因频率极低，故舍弃；

(7)从90只克氏原螯虾为样本，接种抽取500μl血淋巴，提取RNA，之后对每只克氏原螯虾接种病菌副溶血弧菌，具体接种步骤如下：

使用LB培养基培养副溶血弧菌，使其数量达到108个/毫升，取两毫升菌液，使用离心机以5000×g离心5min，弃上清，使用1ml ddH2O重悬沉淀，在每只克氏原螯虾于第5步足关节处，使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液；

(8)对接种副溶血弧菌后的每只克氏原螯虾进行标记，并记录其死亡时间；

(9)检测每只接种副溶血弧菌后的克氏原螯虾ALF基因和Crustin的基因型，并与存活时间形成对应；根据存活时间筛选不同基因型抗病能力差异；通过归纳和总结，筛选抗病能力最强的基因型组合；经过分析得出在两种基因Crustin和ALF的共同作用下拥有基因型Cru-4-ALF-1的抗病效果为最优，所述Cru-4-ALF-1基因为cru基因第46、67、146、151和271位置的碱基依次为T、A、G、T和A，ALT基因第106、110、149、179位置的碱基依次为A、T、C和A。