[发明专利]一种提高克氏原螯虾抗病能力的SNP分子标记及应用

说明书

本发明属于水产养殖分子标记筛选技术领域。具体涉及一种提高克氏原螯虾抗病能力的SNP分子标记及应用。发明的特征为：分别提取随机收集的克氏原螯虾RNA，通过反转录获得其cDNA。根据克氏原螯虾抗病基因Crustin基因和ALF基因序列设计引物组合，利用引物组合对克氏原螯虾cDNA样本进行PCR扩增并得到目的片段，利用琼脂糖胶电泳检测并确认目的片段被扩增出。进一步通过一代测序手段获得其cDNA序列并进行序列比对，鉴定克氏原螯虾群体中Crustin和AFL基因编码区中的SNP位点，对两基因及其组合进行分型；比较各基因型之间抗病能力的差异，筛选得到抗病能力最强的基因型及其组合标记引物。可用于辅助选择。

技术领域

本发明属于水产养殖分子标记筛选的技术领域，具体涉及一种提高克氏原螯虾抗病能力 的SNP分子标记及应用。本发明为克氏原螯虾抗病分子标记的筛选提供了新的资源，应用本 发明可以提高克氏原螯虾种苗抗病的辅助选择，对克氏原螯虾抗病品种或品系的选育具有重 要意义。

背景技术

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)又名红色沼泽螯虾(red swamp crayfish)，俗称“小龙 虾”。隶属于节肢动物门，甲壳纲，软甲亚纲，十足目，螯虾科，原螯虾属。原产地位于墨西 哥北部和美国南部，1918年首次被引种于日本本州地区。在20世纪30年代末期引入我国南京， 由于其极强的环境适应能力和繁殖能力，数量增长极快，在几十年内已遍布长江流域，在部 分湿地中已经形成优势种群，成为重要的水产资源。

克氏原螯虾肉质鲜美，营养丰富，其卵黄腺中含有丰富的不饱和脂肪酸，蛋白质，多种 游离氨基酸，维生素等，深受广大人民群众喜爱。近年来，克氏原螯虾养殖量不断增加，尤 其在湖北地区已成为出口创汇的主打产品，带来巨大经济效益。但是，随着养殖量的不断增 加，各种病害也愈加频繁。由于克氏原螯虾的体内免疫调控机制研究尚未完全明确，又缺乏 对克氏原螯虾病原生物潜伏状况，疾病发生和流行条件的研究。使得病害问题一直阻碍着克 氏原螯虾养殖的发展。自19世纪中期欧洲爆发小龙虾瘟疫之后，克氏原螯虾和其病原的相关 研究就已经开始。除此之外，在20世纪90年代初发现了小龙虾病毒的存在，并引起了研究者 的研究兴趣。虽然克氏原螯虾的病原体研究已经有一些历史，但是有关大多数疾病的病原体， 发病条件，传播途径等信息还是相当缺乏。除此之外，传统正向选育方法，在克氏原螯虾抗 病育种中存在着诸多问题，比如，抗病性状难以界定，种质资源难以保存，抗病能力无法稳 定遗传等。因此克氏原螯虾抗病育种推进缓慢。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷 酸变异所引起的DNA序列多态性，是可遗传变异中最常见的一种，它广泛存在于各种生物之 中，并且具有很高的遗传稳定性。近年来，利用SNP进行品种选育也成为主流的选育手段之 一。SNP育种在动植物中均已取得了各类成果(Vignal,Milan,Sancristobal,Eggen,2002)。而SNP育种的前提条件是已经寻找到功能基因。目前，针对克氏原螯虾抗病基因的研究正在不 断地深入，例如Dai等人发现组织蛋白酶L在克氏原螯虾先天免疫中发挥着重要作用(Dai,Chu, Yu,Li,2017)。除此之外，各种组学及生物信息学也越来越多地应用于克氏原螯虾抗病的研 究。例如，Zhou等利用转录组测序，测定了副溶血弧菌刺激下克氏原螯虾肝胰腺中的基因表 达变化，得到了克氏原螯虾在病原刺激前后的转录组差异表达基因库(Zhou,Zhao,Huang,Ye, Du,2020)。因此，不断丰富的抗病功能基因为SNP育种筛选提供了有力的支持。

本发明利用克氏原螯虾中已经验证的抗病基因，进一步开发其SNP位点，筛选出具有优 良抗病性状SNP基因型。本发明涉及的抗病基因属于已经公开基因信息，与他人无关，本发 明涉及的抗病能力较强的SNP基因型为自主开发，与他人无关。

发明内容