[发明专利]一种更安全的地中海贫血基因治疗载体、构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种更安全的地中海贫血基因治疗载体、构建方法及其应用，属于基因工程技术领域；该载体包括自身失活的慢病毒载体序列和HBB编码多核苷酸基因序列的至少一部分，其中，所述自身失活的慢病毒载体为LentiCRISPv2，所述HBB编码多核苷酸基因序列如SEQ ID No.10所示；人工构建优化的lenti‑HBB血红蛋白真核表达载体可以诱导CD34+细胞向红系细胞分化，稳定表达血红蛋白链，是国内首次在体内外实验成功验证优化第三代lenti‑vector构建载体转染CD34+细胞向红系分化，为下一步进行重型β地中海贫血和血红蛋白病等其它造血系统紊乱血液病临床试验提供理论依据。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种更安全的地中海贫血基因治疗载体、构建方法及其应用。

背景技术

β地中海贫血是由200多个影响β球蛋白基因(HBB)转录和翻译致病突变或11号染色体上HBB缺失/减少所导致的一种遗传性疾病。人体的血红蛋白是由α和β两种珠蛋白组成的异源四聚体。当β珠蛋白发生突变无法表达或功能缺失，就会造成红细胞中聚积过多的α珠蛋白，导致红细胞无法正常形成，其前体过早凋亡。所以患有β地中海贫血的病人必须不断地输血来维持体内的β珠蛋白含量使红细胞能够正常形成。

目前国内针对β地贫如除铁治疗、输血治疗和骨髓干细胞异体移植等常规治疗方法存在费用巨大且配型极其困难问题，而其他方法也仅能够维持患者生命，并不能从源头上根治该疾病。长期的输血会导致体内铁元素过多的聚积，造成铁中毒，因而患者必须定期接受除铁治疗。少数的病人得到了珍贵的造血干细胞或骨髓的成功配对得到了彻底根治这种疾病的机会，但是即使配对成功异体移植仍然存在着很大的免疫排斥风险，患者必须定期服用免疫抑制药物来降低发生排斥的几率。

对于β地中海贫血而言，细胞疗法是一种自体造血干细胞移植疗法，主要通过改造患者自体造血干细胞来提高红细胞中血红蛋白表达水平。目前，慢病毒载体和CRISPR基因组编辑技术介导的细胞治疗是针对β-地贫最有前景的两种方案。虽然慢病毒载体有稳定整合于基因组内并持续表达目的基因的优势，但其整合至基因组的随机性又导致了潜在致瘤风险。为了β地中海贫血后续人体临床试验以及更好的细胞治疗，寻找一个更加安全且有效慢病毒载体以使β球蛋白稳定表达，在我国乃至国际上仍是一个共同目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种更安全的地中海贫血基因治疗载体、构建方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，具有安全有效的优点。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种地中海贫血基因治疗载体，包括自身失活的慢病毒载体序列和HBB编码多核苷酸基因序列的至少一部分，其中，所述自身失活的慢病毒载体为LentiCRISPv2，所述HBB编码多核苷酸基因序列如SEQ ID No.10所示。

进一步地，所述地中海贫血基因治疗载体是在所述自身失活的慢病毒载体的多克隆位点中连接了HBB基因序列的至少一部分。

本发明还提供一种上述的地中海贫血基因治疗载体的制备方法，

将HBB编码多核苷酸基因序列的至少一部分连接到自身失活的慢病毒载体的多克隆位点中，构建地中海贫血基因治疗载体，再将阳性地中海贫血基因治疗载体转染宿主细胞培养，获得地中海贫血基因治疗载体。

进一步地，在所述HBB编码多核苷酸基因序列连接所述自身失活的慢病毒载体时所采用的酶切位点为KpnI和BstEII酶切位点。

本发明还提供一种细胞，包含上述的地中海贫血基因治疗载体。

进一步地，所述细胞为造血干细胞。

本发明还提供一种上述的地中海贫血基因治疗载体或上述的细胞在制备用于预防和/或治疗地中海贫血病药物中的应用。

进一步地，所述地中海贫血病为β地中海贫血。