[发明专利]一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法

说明书

本发明提供一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法，包括以下步骤：荔枝霜疫霉菌孢子囊的产生、游动孢子囊的诱导产生、游动孢子集中释放、游动孢子的收集，配制营养液和培育环境设置，使得诱导荔枝霜疫霉菌产生孢子囊及集中释放游动孢子的最佳条件，短期内即可诱导大量的游动孢子囊并集中释放游动孢子，且获得的孢子囊成囊量大，游动孢子释放率高，萌发率好，既解决了一般方法很难集中释放游动孢子的问题，又避免了利用水培法诱导产生游动孢子囊容易被污染的难题。

技术领域

本发明涉及微生物培养技领域，特别涉及一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法。

背景技术

荔枝霜疫霉病(Peronophythora，litchi)也称荔枝霜霉病、荔枝疫病，其病原为卵菌纲霜疫霉属荔枝霜疫霉菌，是荔枝主要病害之一。该病害最早是在1934年于中国的台湾地区被发现，后来中国大陆荔枝主栽区、澳大利亚、泰国、越南、巴布新几内亚等地相继发现此病害。该病不仅危害近熟果实，同时危害嫩叶、嫩梢、结果枝、幼果从而引起大量落花落果。发病初期，受害花穗为褐色，且大量脱落，果实为暗褐色甚至黑色；发病中后期若遇多雨时节，花穗、果实等变褐色腐烂，病部表面长满白色霜霉状物。荔枝霜疫病在荔枝采后贮藏运输和销售过程中常导致果实腐烂。病菌主要为害近成熟的果实，也为害花穗、幼果、果柄、结果小枝和叶片，常引起大量落果、烂果和贮运期间果品损失。该病的侵染所需时间极短，且荔枝结果期间又多为阴雨天气，若不提前进行防治几乎年年都会流行。我国荔枝霜疫霉病平均发病率在20％以上，严重的高达60％；春雨、梅雨季较长的年份，烂果率达30-50％，严重影响产量、品质以及鲜果的储运和外销，大大限制了荔枝霜产业的发展。因此，研究该病害的致病机理及研发有效的防控措施是我国荔枝产业的重大需求。

研究并明确荔枝霜疫病发生流行规律及病菌的致病机理是研发病害防控技术的前提条件，而研究病害流行规律需进行病菌人工接种技术，其人工接种体是游动孢子，同时，致病机理研究也需要大量的游动孢子进行致病性测定，而传统的获得游动孢子的方法是通过孢子囊释放游动孢子，从而获得最终的接种体，该常规方法产孢量低，产孢时间长，孢子囊很难集中释放游动孢子，不能满足大批量获得游动孢子的目的。因此，很有必要建立一种简易、高效的诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊集中释放，并产生大量游动孢子的方法，旨在为开展荔枝霜疫霉菌的致病机理及揭示病害的发生规律奠定基础，为研发荔枝霜疫病防控措施提供技术支撑。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法，来解决上述产孢量低，产孢时间长，孢子囊很难集中释放游动孢子，不能满足大批量获得游动孢子的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种诱导荔枝霜疫霉菌孢子囊释放游动孢子的方法：包括以下步骤：

(1)荔枝霜疫霉菌孢子囊的产生：在无菌工作台上将切割0.5×0.5cm荔枝霜疫霉菌块接种于装有培养液且直径为11cm的培养皿中，在黑暗条件下培养4～6d，再置于白色日光灯光照700～900lux、温度23～30℃下连续培养1～3d，产生荔枝霜疫霉菌孢子囊；

(2)游动孢子囊的诱导产生：待步骤(1)中的培养皿产满菌丝后，将无菌L型玻棒涂抹长满菌丝的平板，再置于20～30℃中光照静置培养20～30h，即可诱导产生游动孢子囊；

(3)游动孢子集中释放：在步骤(2)的培养皿加入无菌水，收集荔枝霜疫霉菌孢子囊，并移至10～20℃培养箱中静置40～60min，即可释放出大量的游动孢子；

(4)游动孢子的收集：用灭菌后的毛笔轻轻刷洗步骤(3)得到的培养皿表面的菌丝，以达到脱离培养基的目的，过滤，所得到的过滤液即为荔枝霜疫霉菌游动孢子悬浮液。

进一步的，所述步骤(1)中培养液包括以下原料：V8蔬菜汁8～15份、防风草根汁1～6份、荔枝果皮多酚2～10份、二裂酵母发酵产物溶孢物0.3～1.2份、琼脂粉3～8份、去离子水80～100份，所述V8蔬菜汁为美国Campbell Soup Company公司生产。