[发明专利]一种杀伤基因突变肿瘤细胞药物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种杀伤基因突变肿瘤细胞的药物，其特征在于：至少包括重组腺病毒Adv-Cas9^D10A-EGFP、Adv-Donor-gRNA和GCV，所述Adv-Donor-gRNA中的Donor序列包含HSV-TK-Reportergene，其中所述Adv-Cas9^D10A-EGFP用于在肿瘤细胞中基因突变位点附近的DNA链产生两个缺口，所述Adv-Donor-gRNA用于将HSV-TK-Reporter gene序列插入到剪开的缺口中，所述GCV用于靶向性杀伤基因突变肿瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的杀伤基因突变肿瘤细胞的药物，其特征在于：所述GCV浓度为10ug/ml。

3.一种杀伤基因突变肿瘤细胞药物的制备方法，其特征在于：用于制备权利要求1或2所述的杀伤基因突变肿瘤细胞的药物，其包含以下步骤：

S1：设计一对CRISPR/Cas9^D10A基因编辑系统的gRNA；

S2：包装重组腺病毒Adv-Cas9^D10A-EGFP：将Cas9^D10A-EGFP序列克隆到腺病毒穿梭载体上，形成重组腺病毒Adv-Cas9^D10A-EGFP；

S3：包装重组腺病毒Adv-donor-gRNA。

4.根据权利要求3所述的杀伤基因突变肿瘤细胞药物的制备方法，其特征在于：所述S1中，根据肿瘤细胞突变区域的DNA序列，设计长度为20bp的gRNA；设计引物从多合一CRISPR/Cas9载体中扩增得到带T7启动子的gRNA和骨架序列的DNA片段；以扩增得到的DNA为模板，使用试剂盒进行体外转录，得到gRNA产物。

5.根据权利要求4所述的杀伤基因突变肿瘤细胞药物的制备方法，其特征在于：用于扩增的引物序列如下：

Cat-gRNA-F：

5’-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGGCTCCTCCTCTGAGTGGTAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’，

Cat-gRNA-R：

5’-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGCAGAGGAGGAGCTGTGGTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3’，

反向通用引物为：

T7-gRNA-R：

5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC-3’。

6.根据权利要求3所述的杀伤基因突变肿瘤细胞药物的制备方法，其特征在于：所述S3中，根据肿瘤细胞突变位点两侧的序列，设计供体的左右同源臂序列，所述左右同源臂的中间为插入基因HSV-TK和Reporter gene，将donor序列与gRNA连接在一起，构建成Donor-gRNA质粒载体，并进一步包装为重组腺病毒Adv-donor-gRNA。

7.一种杀伤基因突变肿瘤细胞药物的应用，其特征在于：使用权利要求1或2所述的杀伤基因突变肿瘤细胞的药物，包含以下步骤：

S1：将重组腺病毒Adv-donor-gRNA和Adv-Cas9^D10A-EGFP共感染稳定表达突变基因的肿瘤细胞；

S2：Cas9^D10A在gRNA的指引下将突变位点附近的DNA单链剪开一个缺口；

S3：donor序列则可以通过同源重组的方式将HSV-TK-Reporter gene序列插入到被Cas9^D10A剪了缺口的突变位点；

S4：插入后的HSV-TK-Reporter gene会在CMV启动子的驱动下起始转录，翻译后被剪切为HSV-TK和Reporter gene两种蛋白；

S5：加入GCV，诱导细胞死亡。