[发明专利]一种杀伤基因突变肿瘤细胞药物及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种杀伤基因突变肿瘤细胞药物及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域，其中所述杀伤基因突变肿瘤细胞药物至少包括重组腺病毒Adv‑Cas9^D10A‑EGFP、Adv‑Donor‑gRNA和GCV，所述Adv‑Donor‑gRNA中的Donor序列包含HSV‑TK和Reporter gene，其中所述Adv‑Cas9^D10A‑EGFP用于在肿瘤细胞中基因突变位点附近的DNA链产生两个缺口，所述Adv‑Donor‑gRNA用于将HSV‑TK‑Reporter gene序列插入到剪开的缺口中，所述GCV用于靶向性杀伤基因突变肿瘤细胞。本申请提供的杀伤基因突变肿瘤细胞药物，利用CRISPR/Cas9^D10A基因编辑系统的高靶向性和HSV‑TK/GCV自杀基因系统的高杀伤性，准确地将HSV‑TK基因插入发生S45P突变的beta‑Catenin肿瘤细胞中，使用前体药物GCV进行杀伤，可以有效地诱导携带基因突变细胞的死亡，从而达到靶向性杀灭肿瘤细胞的目的。

技术领域

本发明涉及技术领域，尤其涉及一种杀伤基因突变肿瘤细胞药物及其制备方法和应用。

背景技术

人beta-Catenin蛋白是由CTNNB1基因编码的，在细胞黏附和基因转录中具有调控和协调作用。Beta-Catenin是Cadherin蛋白复合物的一个亚基，因此在Wnt信号通路中扮演了胞内信号转导分子的角色。Beta-Catenin在人体许多不同的组织中表达。但是，beta-Catenin的过度表达或突变却和许多癌症密切相关，如肝细胞癌、结肠直肠癌、肺癌、恶性乳腺肿瘤和卵巢癌等。对肝癌基因组大数据分析结果显示，beta-Catenin突变是导致肝癌的主要原因之一，揭示CTNNB1是肝癌的关键驱动基因之一。

Beta-Catenin蛋白由三个结构域组成，包括N末端结构域(～130aa)、中间结构域(141-664aa)及C末端结构域(～100aa)。其中N末端结构域主要由CTNNB1的第三个外显子编码，所以N末端的突变也常被称为外显子3突变。对癌症基因组数据库的分析表明，beta-Catenin蛋白的突变主要发生在编码基因CTNNB1的外显子3上，这些突变与N端编码一些重要调控性氨基酸残基如D32、S33、G34、S37、T41及S45等相关。整合性数据分析表明beta-Catenin mRNA的外显子3突变与患子宫内膜癌的年轻女性病灶早期的侵袭性相关，这提示beta-Catenin突变可以作为侵袭性子宫内膜癌早期诊断的标志。此外，在针对肝癌的分析中揭示，由于beta-Catenin外显子3上S45突变的基因往往是重复多拷贝的，这会导致beta-Catenin的强烈激活，从而导致肿瘤的恶化。由于beta-Catenin在癌症发生发展中的重要作用，研究人员已将其作为主要的抗癌药物作用靶标，但遗憾的是，迄今为止相关的药物研发进展甚微。然而，靶向beta-Catenin基因突变位点还是为我们研发新的抗癌方法提供了一个思路和方向。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来清除入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR/Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，这项技术也是用于基因编辑中前沿的方法。基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，例如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。Cas9是一种核酸内切酶，可以利用一条小向导RNA(single guide RNA,sgRNA)靶向长20bp的特异DNA序列。而在Cas9催化结构域的一个D10A突变(Cas9^D10A)则使其变成一种切口酶(nickase)，只能使靶向的DNA其中一条链产生一个缺口(nick)。利用Cas9^D10A在靶向DNA附近产生2个切口，再利用细胞内同源介导的DNA修复(homology-directed repair,HDR)原理，可以将目的DNA片段准确地插入特定的位点，这比天然的同源重组率高50-1500倍，且脱靶率低于1/10000。这种高效特异性的同源重组方法使得靶向携带基因突变的肿瘤细胞成为一种可能。