[发明专利]一种从柑橘药材中提取DNA的方法

说明书

本发明公开了一种从柑橘药材中提取DNA的方法。柑橘类药材因陈化或干燥时间过长导致其基因组DNA严重降解，使用市面上现有试剂盒提取的DNA浓度太低且含有较多杂质，从而对后续分子生物学分析结果产生严重影响。本研究以广陈皮作为实验材料优化设计了一种从陈化或干燥多年的柑橘药材中提取DNA的方法，为利用分子标记技术准确高效鉴定出柑橘药材的真伪性提供可靠的支持。

技术领域

本发明涉及植物DNA提取方法，尤其是从陈化或干燥多年的柑橘药材中提取 DNA的方法。

背景技术

柑橘(Citrus)属芸香科(Rutaceae)植物，种类繁多。中国作为柑橘重要的原产地之一，拥有丰富的柑橘种类资源和悠久的栽培历史^[1]。在前人的研究中，有多种重要的柑橘药材被开发利用，如陈皮、青皮、佛手、香橼、化橘红、枳实、枳壳等^[2]。因药材的特殊性，保证其真实性、道地性极为重要，而在制作成药过程中，不同的炮制工艺会改变原料的形态、色泽等，故而造成一些道地性药材很容易被掺假、造假，利用常规手段辨识真伪极为困难，如广陈皮与陈皮、化橘红中的毛橘红与光橘红等。

不同生物间基因组DNA各不相同，所以利用现代分子生物学技术可以有效的鉴定出不同样本材料的来源，包括柑橘类药材。但是，炮制后的药材基因组DNA降解严重，使用市面上现有试剂盒提取的DNA浓度太低且含有较多杂质。鉴于此，本课题组以广陈皮和陈皮为材料，优化设计了一种可从陈化或干燥多年的微量柑橘药材中提取高质量DNA的方法，为利用分子标记鉴定柑橘药材的真伪提供了可行性。

发明内容

本发明的目的是提供一种从柑橘药材中提取DNA的方法，柑橘药材由于经过长期陈化或干燥处理，导致基因组DNA降解严重，本发明旨在克服现有提取方法DNA 浓度低、杂质多等问题，从而为柑橘药材的DNA鉴定提供更好的可行性。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种从柑橘药材中提取DNA的方法，包括以下步骤：

①取1g干燥样品，加入0.3-0.5g抗坏血酸和0.3-0.5g PVP-40，用液氮研磨至粉末，称量20-50mg粉末置于离心管中；

②加入1-3mL核分离液，涡旋混匀后离心，弃上清保留沉淀；

③加入1-3mL提取液和3-8μL RNase A，充分混匀后50-55℃恒温水浴10-15h，离心，吸取上清液；

④加入等体积的去蛋白液，充分混匀后离心，吸取上清液；

⑤加入等体积的氯仿/异戊醇(20-30:1，v/v)，充分混匀后离心，吸取上清液；

⑥加入1-3mL异丙醇，-20℃静止10-60min，然后将溶液转移到装有硅胶膜的吸附柱中，高速离心1-5min，弃废液；

⑦向吸附柱中加入400-800μL漂洗液，高速离心10-30s，弃废液；

⑧向吸附柱中加入30-100μL洗脱液，室温放置3-5min后离心，将离心液重新置回吸附柱，室温放置1-3min后离心，收集洗脱液，即得，

其中，核分离液：含0.05-0.2mol/L Tris-HCL，0.01-0.1mol/L EDTA，0.1-0.3mol/L NaCl，1-3％(w/v)PVP-40，1-3％(v/v)β-巯基乙醇；

提取液：含0.05-0.2mol/L Tris-HCL，0.01-0.1mol/L EDTA，1-2mol/L NaCl，1-2.5％ (w/v)CTAB、1-3％(w/v)PVP-40，1-3％(v/v)β-巯基乙醇；

去蛋白液：由Tris-苯酚：氯仿：异戊醇＝20-30:20-30:1(v/v)组成；