[发明专利]高产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供一种高产L‑苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明还提供一种提高苏氨酸发酵产量的方法，所述方法包括弱化发酵菌种(即具有苏氨酸生产能力的细菌)中异柠檬酸脱氢酶基因。本发明通过弱化发酵菌种中异柠檬酸脱氢酶基因，从而减少菌株的异柠檬酸脱氢酶合成，减少异柠檬酸到α‑酮戊二酸和琥珀酰辅酶A过程中CO₂的产生，从而减少碳源损失，来提高菌株生产苏氨酸的能力及糖酸转化率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种高产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-苏氨酸是人和动物生长必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。

随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering ofEscherichia coli for L-threonine production,Mol Syst Biol.2007；3:149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。2016年梅花集团申请的中国专利ZL201611250306.8中，通过强化pntAB基因和异源引入pyc基因获得MHZ-0215-2菌株，该菌株苏氨酸产量为12.4g/L、转化率约为16.2％且无质粒负担。其中icd基因编码异柠檬酸脱氢酶IDH，IDH大多以同源二聚体存在，每个亚基有一个活性中心，两个结合位点。IDH是细菌TCA循环的限速酶，对其能量和物质代谢的调节具有重要作用，其反应为催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸及CO₂。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种提高L-苏氨酸发酵产量的方法，所述方法包括弱化发酵菌种中异柠檬酸脱氢酶基因或者与异柠檬酸脱氢酶的氨基酸序列具有80％以上同源性且表达相同功能蛋白的编码基因；所述发酵菌种为具有苏氨酸生产能力的细菌。

进一步地，所述细菌为埃希氏菌属(Escherichia)或棒杆菌属(Corynebacterium)菌种，优选大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，更优选菌株MHZ-0215-2，其保藏编号为CGMCC No.13403。参见ZL201611250306.8；更优选谷氨酸棒状杆菌SMCT033。

菌株SMCT033按照谷棒经典方法(C.glutamicum Handbook,Charpter 23)构建得到，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032作为出发菌株，通过解除lysC基因反馈抑制并强化其表达，hom、thrB解除反馈抑制并强化其表达，强化thrC基因的表达，失活pck、pyk基因。其中，lysC、hom、thrB、thrC、pck、pyk在NCBI上的参考序列编号分别为1021294、1019166、1019167、1020172、1020806、1020040。