[发明专利]基于核苷酸合成测序图谱的微生物种群鉴定方法及应用

说明书

本发明涉及一种基于核苷酸合成测序图谱的微生物种群鉴定方法及应用。所述微生物种群鉴定方法，通过对微生物的目标片段进行三核苷酸和单核苷酸循环的测序反应，得到测序图谱，根据测序图谱绘制比色带，通过分析比色带或/和测序图谱确定微生物种类；所述三核苷酸为dATPαS、dCTP、dTTP、dGTP中的任意三种核苷酸；所述单核苷酸为不包括早三核苷酸中的另一核苷酸。本发明微生物种群鉴定方法缩短了检测时间，且可通过分析比色带或/和检测图谱，得出检测结果，简化了数据分析过程。本发明微生物种群鉴定方法的应用还包括对定向突变位点的测序。

技术领域

本发明涉及微生物种群鉴定的技术领域，尤其涉及一种基于核苷酸合成测序图谱的微生物种群鉴定方法。

背景技术

微生物种群鉴定测序是基于第二代高通量技术，通过有选择的对微生物的16SrRNA/18SrRNA/ITS等基因序列进行测序，与基因文库比较，鉴定微生物种群的技术。随着微生物种群鉴定测序技术的不断开发与精进，其在疾病预防和治疗等领域的应用也日益广泛。尤其是在临床中，快速、准确的鉴定病原微生物的种类，可加快诊断速度，方便医生对病患进行针对性用药治疗。同时，这一方向的应用也对微生物种群鉴定测序技术提出了更高的使用要求。

微生物种群鉴定测序的具体方法为：提取样品中微生物总DNA，运用PCR技术扩增细菌基因组中的16SrDNA、真菌基因组中的18SrDNA或ITS区域，获得绝大部分微生物16SrDNA、18SrDNA或ITS高可变区的扩增产物，并构建扩增产物的文库；然后，提取待测微生物的DNA，运用PCR技术进行扩增，利用测序平台对扩增产物进行测序，通过将测序结果与基因文库比较分析，鉴别微生物的种类。

目前，常用的基于PCR扩增技术来鉴定微生物种群的方法有Sanger测序和焦磷酸测序，这两种方法准确性高，均通过将PCR产物的序列的碱基信息完全测定，与菌株的特征序列的碱基信息进行比对，来确定微生物种类。然而，在实际应用中，也存在检测过程冗长，检测结果的分析过程繁琐等问题，这大大限制了微生物种群鉴定测序在疾病诊断和治疗上的应用。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的之一在于提供一种基于核苷酸合成测序图谱的微生物种群鉴定方法，该鉴定方法检测周期短，检测准确度高，且分析过程简单。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于核苷酸合成测序图谱的微生物种群鉴定方法，通过对微生物的目标片段进行三核苷酸和单核苷酸循环的测序反应，得到测序图谱，根据测序图谱绘制比色带，通过分析比色带或/和测序图谱确定微生物种类；所述三核苷酸为dATPαS、dCTP、dTTP、dGTP中的任意三种核苷酸；所述单核苷酸为不包括在三核苷酸中的一固定核苷酸。

进一步的，具体包括以下步骤：(1)提取微生物的DNA模板，并在聚合酶的作用下PCR扩增部分可变区；(2)将扩增产物与测序引物结合；(3)交替循环加入三核苷酸和单核苷酸进行焦磷酸测序，得到测序图谱；(4)根据测序图谱绘制比色带；(5)由比色带或/和测序图谱分析微生物种群。

进一步的，所述测序图谱包括由核苷酸数目、核苷酸种类、信号强度以及三核苷酸和单核苷酸的位置排布构成的全部信息。

进一步的，所述测序图谱的分析方法包括：通过分析单核苷酸的位点确定微生物的种类。

进一步的，所述比色带包括依次设置的若干单元，一单元对应一核苷酸位点；所述三核苷酸所占单元位标记为区域A，所述单核苷酸所占单元位标记为区域B。

进一步的，比色带的分析方法包括：将微生物的比色带与相似比色带叠加设置，根据重合程度确定微生物种类。

本发明基于核苷酸测序图谱的微生物种群鉴定方法的有益效果为：