[发明专利]一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法

权利要求书

1.一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：根据CsAlaDC和CsTSI的ORF序列，及植物表达载体pCAMBIA1305、pK7WGF2载体上多克隆位点，分别设计含有相应酶切位点的引物；

S2：以茶树cDNA为模板对步骤S1中设计得到的引物进行PCR扩增，扩增得到的PCR产物连接到pEasy-Blunt载体上；

S3：将连接pEasy-Blunt的CsAlaDC的核苷酸序列及pCAMBIA1305空载体进行双酶切，将酶切产物进行电泳，并对目的条带进行凝胶产物回收，酶连，将回收后的核苷酸序列和空载体按比例混匀，反应8h，之后将酶连产物转入Trans-T1中进行验证，获得重组阳性克隆后进行质粒提取，得到pCAMBIA1305-CsAlaDC；

S4：将连接pEasy-Blunt的CsTSI的核苷酸序列通过Gateway体系构建到pK7WGF2载体上，得到pDONR207-CsTSI，LR反应6-8h，反应结束后将LR反应混合物转Trans-T1中进行验证，获得重组阳性克隆后进行质粒提取，得到pK7WGF2-CsTSI；

S5：将步骤S3和步骤S4中得到的重组质粒pCAMBIA1305-CsAlaDC和pK7WGF2-CsTSI加入农杆菌中，在无抗LB液体培养基中培养2～3h，取菌液涂于Spec和Rif抗性的培养基平板上，培养1～2天；

S6：将步骤S5中培养1～2天后的农杆菌离心，收集菌体，用MMA溶液重悬菌体至菌液OD值为0.6～0.8，加入AS溶液后在室温避光活化2～3h，去上清，得到菌液注入非茶植物叶片背面。

2.如权利要求1所述的一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S1中茶树丙氨酸脱羧酶基因CsAlaDC的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，茶树丙氨酸脱羧酶基因CsAlaDC编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。

3.如权利要求1所述的一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S1中茶树茶氨酸基因CsTSI的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，茶树茶氨酸基因CsTSI编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。

4.如权利要求1所述的一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S2中的cDNA模板为茶树舒茶早品种根部cDNA。

5.如权利要求1所述的一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S3中回收后的核苷酸序列和空载体的比例为2：6。

6.如权利要求1所述的一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S4中得到pDONR207-CsTSI的具体过程如下：根据Gateway克隆手册attBPCR引物的设计要求设计上下游引物接头如下：Getway-F:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTT，Getway-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC，经过PCR反应克隆目的基因全长之后凝胶回收目的条带，BP反应6-8h，反应结束后将BP反应混合物转Trans-T1中进行验证，获得重组阳性克隆后进行质粒提取，得到pDONR207-CsTSI。

7.如权利要求6所述的一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法，其特征在于，所述BP反应的反应条件为：1μL attBPCR Product，0.5μLpDONR207载体，0.5μLBPenzyme，ddH₂O补足5μL，25℃孵育。

8.如权利要求1所述的一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法，其特征在于，所述步骤S3中LR反应的反应条件为：1μL pDONR207-CsTSI质粒，0.5μLpK7WGF2载体，0.5μLLRenzyme，ddH₂O补足5μL，25℃孵育。