[发明专利]一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种在非茶植物中合成L‑茶氨酸的方法；首先克隆了茶树茶氨酸合成途径中的两个关键基因，分别是CsAlaDC和CsTSI基因，将CsAlaDC和CsTSI的核苷酸序列分别构建到pCAMBIA1305和pK7WGF2植物表达载体上，随后通过农杆菌介导的瞬时转化将这两个重组质粒在烟草叶片中共同表达，这种在非茶植物中合成L‑茶氨酸的方法，实现了安全、绿色、高效且低成本的生物合成L‑茶氨酸，并且是能在非茶植物烟草中合成茶氨酸。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种在非茶植物中合成L-茶氨酸的方法。

背景技术

茶氨酸(L-theanine)是茶树中特有的非蛋白质氨基酸，占茶叶干重的1％-2％，占所有氨基酸的50％以上。茶叶中的鲜爽味主要来源于茶氨酸，其含量与绿茶品质密切相关，是评价绿茶品质的重要指标。此外，茶氨酸具有多种功能活性，可以保护神经系统。茶氨酸可以减轻脑组织损伤、抑制脑神经死亡、使缺血后脑损伤的发生延迟，保护神经等功效，在缓解压力、促进睡眠、抗焦虑、抗抑郁、提高学习能力和记忆等方面都有良好的药理作用。安全性评估表明茶氨酸是一种十分安全的食品原料。L-茶氨酸因其独特的生物学功能，在食品、保健品、医药等领域有巨大的应用价值，所以实现L-茶氨酸的工业化生产尤为重要。

目前茶氨酸的制备方法主要有三种：直接提取法、化学合成法和微生物酶法。L-茶氨酸仅占茶叶干重的1％-2％，另外由于缺乏简便、特异和高效的分离方法，高纯度的L-茶氨酸的提取和分离通常涉及耗时高成本和复杂的操作过程，不利于工业化生产。化学合成法具有方法简单、成本低、产率高等优点，但是合成的茶氨酸为L-和D-形式的外消旋混合物，通常被认为是“非天然”产物，且会残留毒性物质。酶催化法合成L-茶氨酸有底物廉价、催化过程安全，产物纯度高等有点，但是该方法体系中涉及ATP再生，生产成本上升；催化体系底物转化效率低，乙胺盐大量残留。

中国专利公布CN104561160A公开了生物法制备茶氨酸的方法：将硝基还原假单胞菌菌株进行培养得到菌液，对菌液进行过滤得到菌体，将得到的菌体添加到L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐中进行反应，经脱色、膜过滤等步骤得到茶氨酸粉剂或茶氨酸晶体。该工艺酶反应体系里不含有碳源、氮源等培养成分，相对于发酵液而言反应液成分简单，可大幅度提高产品纯度，同时具有酶源与反应液易分离，后处理简单、生产周期短、产量高、环境污染小及成本低等优点。但是，该制备方法需要在反应的过程中同时添加前体物质L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐，这在一定程度上增加了生产成本。

中国专利公布CN104830941A公开了一种混合菌种微生物转化法高效合成L-茶氨酸的方法，该方法采用黄色短杆菌和硝基还原假单胞菌进行混合发酵，发酵结束后将发酵液升温进行菌体灭活处理，然后加入乙胺进行合成转化。该方法利用黄色短杆菌发酵产生谷氨酰胺，硝基还原假单胞菌发酵产生催化酶，并且在不需分离纯化谷氨酰胺的条件下添加乙胺，酶催化生成L-茶氨酸。该方法省略了谷氨酰胺前体的添加，而且直接使用微生物发酵产生的谷氨酰胺，在一定程度上降低了生产成本。但是，该方法生产周期长、L-茶氨酸产量低。

目前，多数是运用微生物产生的酶，以谷氨酰胺和乙胺为前体，合成茶氨酸。催化L-茶氨酸合成的酶主要有：茶氨酸合成酶(TS)、L-谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)，L-谷氨酰胺合成酶(GS)，γ-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)。其中，茶氨酸合成酶是茶叶中的生物合成酶，但是茶氨酸合成酶极不稳定并且难以分离；其他五种酶来自微生物，比较方便进行利用，但是仍存在底物浓度偏低和转化效率不高的问题。