[发明专利]一种重组角蛋白生产方法

权利要求书

1.一种重组角蛋白生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、发酵准备：配置需要用灭菌锅灭菌的种子培养液，灭菌锅灭菌，配置发酵罐盐培养基1，清洗发酵罐；

S2、空罐灭菌：灭菌前关闭发酵罐所有阀门，打开蒸汽发生器，15～25min后，在控制面板点击灭菌操作，进行多阶段灭菌；

S3、实罐灭菌：取出灭菌锅灭菌的溶液，混合补料，排水，加入发酵罐盐培养基1后进行灭菌；

S4、接种，将重组角蛋白种子液接种在冷却至室温的种子液培养基中；

S5、发酵：发酵罐准备，打开发酵罐的搅拌开关，将发酵罐的转速、温度、流速由手动设置为自动；在发酵罐罐顶阀处点燃酒精棉，再打开罐顶阀，加入接种的种子液培养基，再加入发酵罐盐培养基2，关闭罐顶阀，开始发酵；

S6、取样：调节转速为300～700rpm，加碱调节PH值为7.0～7.5，加补料，诱导，诱导后取样检测，将发酵罐的温度、转速、压力、流速、PH值由自动设置为手动，然后将发酵液进行离心操作，收集沉淀得到菌体在冰箱中保存，发酵结束；

S7、破菌：从冰箱中取出菌体，按照1：20加入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液，搅拌溶解，用高压匀浆机破菌，将高压匀浆机的压力设置为800～1200Bar，温度设置为4～6℃，破菌5次，离心收集菌体沉淀；

S8、纯化：配置平衡缓冲液，配制8mol/L的尿素，按25Mm/L的量加入PB溶液，溶解过滤，PH值调至7.8，用1mol/L尿素溶液洗涤菌体沉淀，离心收集菌体沉淀，用8mol/L尿素溶液溶解菌体沉淀，加入适量的PB溶液，用磁力搅拌器搅拌，然后离心后取上清液，用平衡缓冲液稀释后过滤，调节其PH值为7.8，作为上样样品；

打开紫外检测仪和蠕动泵，将蠕动泵的数值调到8.0用纯水将1L层析柱填料中的20％酒精冲洗干净，纯水冲洗后，用平衡缓冲液冲洗层析柱，使得紫外检测仪数值稳定，将紫外检测仪的光量值调到零；

将上样样品注入到层析柱内，然后用平衡缓冲液冲洗层析柱后，用洗脱液1和洗脱液2依次进行洗脱，同时分别收集样品；

S9、透析：选取透析袋，将样品装入透析袋内并封闭透析袋，将装入样品的透析袋放入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液的透析液中过夜，取出，抽滤得到重组角蛋白样品；

S10、Q柱纯化：将保存好的Q柱连接到纯化仪上，调节流速为5.0，打开纯化仪电源进行清洗；

配置上样平衡液、洗脱液3和洗脱液4；

用纯水冲洗Q柱，然后上样平衡液，观察紫外吸收度数值，直至其数值平稳无波动后归零；

将重组角蛋白样品注入Q柱内，流速调为3.0，观察吸光度数值变化，当数值快速上升至一定数值时，接收出液管流出的液体即为穿透液，当吸光度数值开始下降至一定数值时停止接受，并记录下降值；

S11、洗脱：重组角蛋白样品上样完后，向Q柱内继续注入上样平衡液，待穿透液接收完成后，至吸光度数值再次平衡稳定后，将上样平衡液换成洗脱液3，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；洗脱液3上样完毕后，继续上样平衡液，待洗脱液3接收完毕后，将出液管放入废液桶内，至吸光度数值再次平衡稳定后，继续上样洗脱液4，待吸光度数值快速上升至一定数值时将出液管放入干净的锥形瓶中接收液体即为洗脱液4，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；

S12、清洗Q柱并封口保存。

2.根据权利要求1所述的重组角蛋白生产方法，其特征在于，按质量计算，所述S1步骤中种子液培养基按照每升种子液精准称取Yeast Extract 10g、Tryptone 20g，NaCl 20g，葡萄糖10g用蒸馏水溶解并定容至2L，并且在121℃下灭菌30min。

3.根据权利要求1所述的重组角蛋白生产方法，其特征在于，按质量计算，所述S1步骤中发酵罐盐培养基1的配置方法：按照每升种子液精准称取磷酸氢二钠十二水500g，磷酸二氢钾50g，氯化铵20g，氯化钠15g，消泡剂1ml，酵母粉80g，蛋白胨100g，用纯水溶解并定容至18L，并且在121℃下灭菌30min。