[发明专利]一种茯苓多肽及其抗病毒作用

说明书

本发明公开了一种茯苓多肽，所述多肽序列包括：WQLGLAYVL、MTAANIGVSRII或LALPALALP。本发明采用以复酶水解茯苓蛋白，通过离子交换净化、反相液相色谱分离、四极杆‑静电场轨道阱高分辨质谱鉴定，获得了的多肽经体外细胞毒性测定及体外抗单纯疱疹病毒（HSV‑1）病毒活性实验验证，具有抗病毒作用。

技术领域

本发明属于天然产物提取领域，提出了一种具有抗病毒作用的茯苓多肽制备方法。

背景技术

生物活性肽是指少于100个氨基酸通过脱水缩合而成，且相对分子质量低于6 kDa的具有生物活性的多肽^[1-2]。生物活性肽因其具有抗氧化、抗高血压、抗癌、抗菌等特性受到广泛关注^[3]。近年来，在天然动、植物及微生物体内相继发现了大量的抗病毒肽，这类肽可通过抑制病毒入侵、病毒蛋白合成及提高免疫力等方面发挥抗病毒功效，是诸多抗病毒策略中的研究热点^[4]。

茯苓俗称去苓、松苓，为寄生在松树根上的一种真菌，茯苓与茯苓皮均可入药。据《中华人民共和国药典》(2020版)记载，茯苓为多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核；茯苓皮为多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos(Schw.)Wolf菌核的干燥外皮。

茯苓是传统药食同源产品，在我国有悠久的应用历史。早在1700多年前的《神农本草经》就将其列为上品，主要功效包括利水渗湿，健脾，宁心等。据统计，我国常见中药处方中有70%使用到茯苓。现代药理学研究表明，茯苓提取物中的三萜类化合物和多糖具有多种生理活性，如提高机体免疫力、抗菌、降糖、抗肿瘤等作用。本文采用以复酶水解茯苓蛋白，通过离子交换净化、反相液相色谱分离、四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱鉴定，获得了的多肽经体外细胞毒性测定及体外抗单纯疱疹病毒（HSV-1）病毒活性实验验证，具有抗病毒作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茯苓多肽及应用，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种茯苓多肽，所述多肽序列包括：WQLGLAYVL、MTAANIGVSRII或LALPALALP。

进一步地，将上述多肽应用于制备抗病毒制剂中。

上述多肽的制备方法包括以下步骤：

（1）提取：在研细过筛的茯苓粉中加入Tris-HCl缓冲液，37 ℃水浴60 min，取出冷冻离心，取上清液用盐酸溶液调节至有絮状沉淀，再冷冻离心后弃上清液取沉淀，-70℃预冻24 h后，- 50℃真空冷冻干燥48 h，得茯苓冻干蛋白；

（2）酶解：取茯苓冻干蛋白溶于HCl溶液中，加入胃蛋白酶于37 ℃水浴酶解12 h，冷冻离心后取上清液以 NaOH溶液调节pH 至8.0，加入 NH₄HCO₃缓冲溶液，加入胰蛋白酶于于37 ℃水浴酶解12 h后，沸水浴灭活后冷冻离心，取上清液备用；

（3）净化：MAX SPE柱先后以5mL甲醇、5mL水活化，将上述酶解液上样，依次用3mL5%氨水、1mL甲醇淋洗，抽干淋洗液，以10mL 5%甲醇溶液洗脱，洗脱液于45℃氮吹干，以1mL 1 %甲酸溶液溶解，过0.22 µm滤膜，进行色谱分离、质谱检测、电喷雾离子源检测。

所述色谱条件为：Hypersil GOLD C18色谱柱，100m × 2.1 mm，1.9 µm；柱温：30℃；流动相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，洗脱梯度：0~50 min，乙腈10%~90%；50~55 min，乙腈90%；55~56 min，乙腈90%~10%；56~60 min，乙腈10%；流速：0.3 mL/min；进样量：10 µL。