[发明专利]一种小鼠乳鼠原代心肌细胞分离与培养方法及其应用

说明书

本发明是一种小鼠乳鼠原代心肌细胞分离与培养方法及其应用，具体为：采用吸入乙醚麻醉乳鼠，取出跳动的心脏，将心脏置于预冷D‑hank’s溶液中，心脏碎组织2次，心肌细胞分离酶A溶液加入心肌细胞分离酶B溶液中混匀后加入心脏组织，用预冷D‑hank’s溶液清洗心脏碎组织2次，加入培养基，接种至培养皿，将培养皿中的上清液移至离心管中混匀后接种至新的培养皿，将培养皿中的上清液移至离心管中混匀，接种至培养皿中进行培养，以后隔天更换至细胞接触形成节律性收缩。本发明提供的了一种分离小鼠乳鼠的心脏为含单个心肌细胞的细胞悬液的实验操作方法，适用于多种品系小鼠乳鼠心肌细胞的分离，后小鼠乳鼠的心脏相关实验提供基础保证。

技术领域

本发明涉及生物技术领域领域，具体来说是一种小鼠乳鼠原代心肌细胞分离与培养方法及其应用。

背景技术

心血管疾病是人类健康的首要杀手。体外培养的心肌细胞排除了体内各种神经体液因素的干扰，是研究心肌细胞功能和机制的理想的。目前体外培养的心肌细胞主要分为商品化的心肌细胞系和从乳鼠心脏分离培养的原代心肌细胞。商品化的心肌细胞虽然保留了心肌细胞某些特性，但丧失了心肌细胞最重要的自主节律性舒缩功能。体外分离的原代心肌细胞很好的保留了心肌细胞的自主节律性。目前，大鼠原代心肌细胞的分离培养方法相对比较成熟，小鼠原代心肌细胞的分离和培养方法明显不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种小鼠乳鼠原代心肌细胞分离与培养方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种小鼠原代心肌细胞的分离与培养方法，包括从乳鼠心脏分离心肌细胞和分离的心肌细胞的培养步骤，具体为：

(1)、采用吸入乙醚麻醉乳鼠，用酒精消毒乳鼠胸壁，剪开胸壁，取出跳动的心脏；

(2)将心脏置于预冷D-hank’s溶液中，剪去左右心耳，用注射器将预冷D-hank’s溶液冲洗心室至流出液澄清，将心室部分置于新的预冷D-hank’s溶液中

(3)用眼科剪将心脏剪碎至1-3mm³碎块，用预冷D-hank’s溶液清洗心脏碎组织2次再弃去D-hank’s溶液；

(4)将50μL心肌细胞分离酶A溶液加入2.5μL心肌细胞分离酶B溶液中轻轻混匀后加入剪碎的心脏组织中，于CO₂培养箱中37℃培养30min后弃去上清液，用预冷D-hank’s溶液清洗心脏碎组织2次；

(5)加入完全DMEM培养基，吹打混匀心脏组织成单细胞悬液，接种至培养皿中置于CO₂培养箱中差速贴壁30min；

(6)将上述培养皿中的上清液移至离心管中混匀后接种至新的DMEM培养皿中置于CO₂培养箱中差速贴壁30min；

(7)将上述培养皿中的上清液移至离心管中混匀，以2.5×10⁵/cm²接种至DMEM培养皿中进行培养，24h更换培养基，以后隔天更换至细胞接触形成节律性收缩。

进一步的，步骤(5)中，所述DMEM培养基为：DMEM基础培养基、添加10％胎牛血清、添加1％青链霉素。

D-hank’s为市售产品，具体生产厂家为武汉普诺赛生命科技有限公司，PB180322；心肌细胞分离酶A和心肌细胞分离酶B为市售产品，具体生产厂家为赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：88281Y。

本发明的有益技术效果是：本发明所提供的了一种分离小鼠乳鼠的心脏为含单个心肌细胞的细胞悬液的实验操作方法，适用于多种品系小鼠乳鼠心肌细胞的分离，后小鼠乳鼠的心脏相关实验提供基础保证。

附图说明