[发明专利]一种点突变BIRC5抗原表位肽筛选的方法

说明书

本发明涉及一种筛选点突变BIRC5抗原表位肽的方法，具体步骤如下：步骤1)：利用NetMHCpan 4.1和SYFPEITHI在线预测系统对BIRC5抗原9氨基酸残基的CTL表位肽进行全面预测，同时通过点突变技术改变相应氨基酸残基种类，提高在线预测的评分；步骤2)：根据步骤1)得到的氨基酸序列，人工合成相应表位肽与T2细胞共孵育，从而检测表位肽与HLA‑A2分子的实际结合能力；步骤3)：利用步骤2)筛选获得的突变肽在体外建立特异性CTLs克隆，并利用ELISPOT实验和钙黄绿素杀伤等方法，来鉴定突变肽诱导的CTLs特异性识别杀伤靶细胞的免疫学活性。本发明为进一步肿瘤肽疫苗的制备奠定了基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种点突变BIRC5抗原表位肽筛选的方法。

背景技术

人类的BIRC5基因全长14.7kb，定位于17q25染色体上，含4个外显子及3个内含子，该基因在多种肿瘤组织中高表达，而在机体正常分化组织中表达量很低BIRC5是较为公认的具有潜在应用价值的肿瘤抗原靶点。

针对肿瘤抗原靶点，在特异性肿瘤免疫治疗中细胞毒T淋巴细胞通过识别与特定MHC-Ⅰ类分子结合的CTL表位肽，进而被活化发挥抗肿瘤效应。因此在众多抗肿瘤实验研究中，寻找与MHC分子结合稳定且能有效激活CD8⁺T细胞的CTL抗原表位十分有必要。MHC-Ⅰ类分子所结合的抗原表位肽通常为8-10个氨基酸残基，以9残基多见，常规的CTL表位肽筛选方法包括CTL克隆筛选法、重组cDNA文库血清学分析法和多肽洗脱法等。这些方法大都实验操作复杂，费时费力，对CTL表位肽的筛选效率低下。例如重组cDNA文库血清学分析法需要至少1×10⁶以上的库容量，在实际应用中构建一个高质量的cDNA文库并不是一件容易的事。又例如多肽洗脱法虽可获得肿瘤抗原的天然抗原多肽，但其对仪器水平要求高，技术难度大，故应用范围较小。那么如何快速、精准、廉价的筛选出这种有应用价值的CTL抗原表位，在肿瘤疫苗的设计、T细胞识别功能、过继性细胞疗法等研究中都具有极为重要的意义。

随着生物信息学技术的发展及相应数据库的建立，利用计算机软件对已知蛋白(已知其氨基酸组成)的T细胞表位进行预测分析成为可能，再结合试验验证将大大提高CTL表位筛选效率，这种生物信息学分析法已成为极有潜力的CTL表位肽筛选法。目前，用于CTL表位预测的常用远程在线预测软件有NetMHCpan 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)和SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)两大系统，而抗原递呈相关转运蛋白(transporter associatedwith antigen processing,TAP)缺陷的B细胞瘤来源T2细胞则常用来进行表位肽与MHC分子结合稳定性的检测。但是，由于中枢性免疫耐受现象，该方法筛选出来的评分高的野生肽在绝大多数的临床试验中效果不佳。因为绝大部分TAA都属于自身抗原，根据T淋巴细胞发育的经典理论，T淋巴细胞的发育经过阴性选择过程使识别这些抗原的高亲和力T细胞被克隆清处，所以在成人体内可能只存在着部分识别这些肿瘤抗原的低亲和力T细胞。由于通常情况下自身抗原与MHC分子的结合力较为低下，这些低亲和力T细胞上的TCR分子难以有效识别肿瘤抗原肽，就不能引起T细胞的有效活化扩增，这就形成了一种针对肿瘤抗原的免疫耐受现象。因此为了打破免疫耐受，激活低亲和力的TAA特异性CTL是杀伤肿瘤细胞的关键。