[发明专利]EGFR适配子修饰负载miR-375及PTX的RNA纳米药物及制备方法和应用

权利要求书

1.EGFR适配子修饰负载miR-375及PTX的RNA纳米药物，其特征是：该纳米药物以RNA纳米4WJ为核心，负载具有显著食管鳞癌细胞抑制作用的miR-375及PTX，同时对载体进行EGFR适配子修饰。

2.根据权利要求1所述的EGFR适配子修饰负载miR-375及PTX的RNA纳米药物，其特征是：以该RNA纳米药物为核心，制备靶向修饰的其它纳米药物体系。

3.根据权利要求1所述的EGFR适配子修饰负载miR-375及PTX的RNA纳米药物，其特征是：以该RNA纳米药物为核心，制备负载其它治疗性制剂的纳米药物体系。

4.根据权利要求1所述的EGFR适配子修饰负载miR-375及PTX的RNA纳米药物的制备方法，其特征是该制备方法包括以下步骤：

(1)RNA寡核苷酸合成：合成寡核苷酸rG、rG、rC、rU、2’F rC2’F rU磷酰胺单体、2’O-propargyl rC以及rU磷酰胺单体，将其通过脱盐柱进行脱盐处理后通过凝胶电泳进行分析纯化；

(2)PTX-叠氮化合物合成：PTX、6-叠氮己酸，N、N′-二环己基碳二亚胺和4-(二甲氨基)吡啶以1:2:2:1摩尔比浓度加入10mL二氯甲烷中；混合溶液室温搅拌过夜16h，通过过滤和旋转蒸发得到粗产品；粗产品通过硅胶柱层析，由体积比5：5的己烷：乙酸乙酯的洗脱液下来并随后旋转蒸发得最终PTX-叠氮化合物产品；

(3)RNA寡核苷酸-PTX复合物合成：2mM的RNA寡核苷酸-6炔烃与50mM的PTX-N3按体积比5:2充分混合在体积比3:1的二甲亚砜/叔丁醇中，然后加入硫酸铜/三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)和抗坏血酸钠，混合溶液在4℃振荡16h；其中，RNA：PTX：Cu+摩尔浓度比为1:15:20；反应结束后，往混合溶液中加入1/10体积的0.3M的醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇沉淀RNA寡核苷酸；RNA寡核苷酸-紫杉醇复合物纯度通过16％(w/v)8M尿素聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)；其中，凝胶电泳使用的TBE缓冲液中：89mM三碱基硼酸盐，2mM EDTA；

(4)RNA纳米药物的组装：

4WJA:5′^-uuA GG^u AAA G^cc Acc uGc AGG uGc uAc^cGA uG^u AAu u^cA A-3′；

4WJB:5'^-uuG AA^u uAc A^uc GGu AGc AcG GGc uGu G^cG AGG^cuG AA^c AG-3'；

4WJB-miR375:5'^-uuG AA^u uAc A^uc GGu AGc AcG GGc uGu G^cG AGG^cuG AA^cAG GcG AcG AGc ccc UcG cAc AAA cc-3'；

4WJC-EGFR:5′^-cuG uu^c AGc c^uc GcA cAG ccA GcA^cGc Ac^c uGA A^uA GGu GccuuAGuAAcGuGcuuuGAuGucGAuucGAcAGGAGGc-3’，下划线部分为EGFR适配子；

4WJD:5’^-ccu Au^u cAG G^uG cGu Gcu GGG cuG cAG G^uG Gcu u^uA cc^u AA-3′；

miR-375:5'-UUU GUU CGU UCG GCU CGC GUG A-3'；

^代表连接紫杉醇的位置；小写字母代表2’F修饰得碱基单体；将上述寡核苷酸链以相同摩尔浓度在TES缓冲液中混合，90℃变性10min，并逐渐冷却至4℃；其中，TES缓冲液中：50mM Tris pH＝8.0，50mM NaCl，1mM EDTA；纳米颗粒组装效率和纯度通过12％(w/v)的非变性凝胶电泳验证；其中，凝胶电泳环境使用1ⅹTBE缓冲液中：89mM Tris碱、200mM硼酸和2mM EDTA。

5.EGFR适配子修饰负载miR-375及PTX的RNA纳米药物的应用，其特征是：该RNA纳米药物应用于食管鳞癌的治疗。