[发明专利]EGFR适配子修饰负载miR-375及PTX的RNA纳米药物及制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种EGFR适配子修饰负载miR‑375及PTX的RNA纳米药物及制备方法和应用，该纳米药物以RNA纳米4WJ为核心，负载具有显著食管鳞癌细胞抑制作用的miR‑375及PTX，同时通过EGFR的修饰，进一步增强纳米载体的肿瘤靶向性，与4WJ‑miR‑375‑PTX相比，具有更好的食管鳞癌靶向及渗透作用，具有更好的抗食管鳞癌能力。

技术领域

本发明属肿瘤靶向治疗领域，涉及用于肿瘤靶向治疗的RNA纳米药物，具体涉及一种EGFR适配子修饰的、同时负载miR-375及PTX的RNA纳米药物 EGFR-4WJ-miR-375-PTX及其制备方法和应用。

背景技术

我国食管癌发病率、死亡率居全球首位，治疗仍以手术及传统的放化疗为主，其中化疗药物的应用在晚期食管癌治疗中仍是最为重要的治疗手段之一，但化疗药物治疗靶向性的缺乏及其严重毒副反应极大地限制了其治疗效果。寻求新的靶向治疗策略以提升疗效是当前食管癌研究的重点和难点。随着纳米科技的发展，纳米药物的开发成为肿瘤靶向治疗研究的热点。纳米药物须兼备实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)介导的被动靶向效应及各种修饰介导的主动靶向效应以发挥其高效的抗肿瘤作用。目前临床常用的白蛋白以及脂质体纳米药物仅能通过其介导的被动靶向效应发挥作用，虽有所提高常规化疗药物的抗肿瘤效果，但与大多纳米载体一样，存在显著的非靶器官分布效应，药物靶向递送效率仍偏低。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种EGFR适配子修饰的、同时负载miR-375 及PTX的RNA纳米药物EGFR-4WJ-miR-375-PTX；本发明的第二个目的在于提供 EGFR-4WJ-miR-375-PTX的制备方法；本发明的第三个目的在于提供纳米药物 EGFR-4WJ-miR-375-PTX在食管鳞癌治疗方面的应用。

本发明的技术解决方案是：一种EGFR适配子修饰的、同时负载miR-375及 PTX的RNA纳米药物EGFR-4WJ-miR-375-PTX，该纳米药物以RNA纳米4WJ为核心，负载具有显著食管鳞癌细胞抑制作用的miR-375及PTX，并进行EGFR适配子修饰。

更进一步的是，以该RNA纳米药物为核心，制备靶向修饰的其它纳米药物体系。

更进一步的是，以该RNA纳米药物为核心，制备负载其它治疗性制剂的纳米药物体系。

其中，该RNA纳米药物的制备方法包括以下步骤：

(1)RNA寡核苷酸合成：合成寡核苷酸rG、rG、rC、rU、2’F rC2’F rU 磷酰胺单体、2’O-propargyl rC以及rU磷酰胺单体，将其通过脱盐柱进行脱盐处理后通过凝胶电泳进行分析纯化；

(2)PTX-叠氮化合物合成：PTX、6-叠氮己酸，N、N′-二环己基碳二亚胺和4-(二甲氨基)吡啶以1:2:2:1摩尔比浓度加入10mL二氯甲烷中；混合溶液室温搅拌过夜16h，通过过滤和旋转蒸发得到粗产品；粗产品通过硅胶柱层析，由己烷：乙酸乙酯(体积比5：5)洗脱液下来并随后旋转蒸发得最终PTX- 叠氮化合物产品；

(3)RNA寡核苷酸-PTX复合物合成：RNA寡核苷酸-6炔烃(2mM)与PTX-N3 (50mM)按体积比(5:2)充分混合在二甲亚砜/叔丁醇(体积比3:1)中，然后加入硫酸铜/三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)和抗坏血酸钠(RNA：PTX：Cu+摩尔浓度比为1:15:20)，混合溶液在4℃振荡16h；反应结束后，往混合溶液中加入1/10体积的0.3M的醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇沉淀RNA寡核苷酸；RNA寡核苷酸-紫杉醇复合物纯度通过16％(w/v)8M尿素聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)；凝胶电泳使用TBE缓冲液(89mM三碱基硼酸盐，2mM EDTA)；

(4)RNA纳米药物的组装：