[发明专利]重组嗜盐单胞菌及构建方法及催化柠檬酸制备衣康酸的应用

权利要求书

1.一种重组嗜盐单胞菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：

(1)在野生型嗜盐单胞菌Halomonas sp.TD01保藏登记号为CGMCCNo.4353基因组上整合Mmp1 RNA聚合酶表达单元，得到Halomonas sp.TD1.0；

再将Halomonas sp.TD1.0基因组上异柠檬酸脱氢酶编码基因icd的起始密码子ATG替换为TTG，得到Halomonas sp.TD2.0；

所述异柠檬酸脱氢酶编码基因icd的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)在高拷贝表达载体pN59多克隆位点区域插入P_Mmp1-RBS-cadA-acn，得到高拷贝表达载体pN59-P_Mmp1-RBS-cadA-acn；

所述高拷贝表达载体pN59的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述P_Mmp1为IPTG诱导型启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述RBS为大肠杆菌Escherichia coli MG1655强核糖体结合位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述cadA为土曲霉Aspergillus terreus来源的经密码子优化得到的顺乌头酸脱羧酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述acn为谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032来源的顺乌头酸酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

(3)在低拷贝表达载体pN85多克隆位点区域插入P_Mmp1-RBS-GroESL，得到表达载体pN85-P_Mmp1-RBS-GroESL；

在表达载体pN85-P_Mmp1-RBS-GroESL的GroESL基因后再插入P_Mmp1-RBS-acn，得到低拷贝表达载体pN85-P_Mmp1-RBS-GroESL-P_Mmp1-RBS-acn；

所述低拷贝表达载体pN85的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述GroESL是嗜盐单胞菌Halomonassp.TD01来源的分子伴侣基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

(4)向步骤(1)获得的Halomonas sp.TD2.0中导入高拷贝表达载体pN59-P_Mmp1-RBS-cadA-acn，得到Halomonas sp.IA01；

(5)向步骤(4)获得的Halomonas sp.IA01中导入低拷贝表达载体pN85-P_Mmp1-RBS-GroESL-P_Mmp1-RBS-acn，得到重组嗜盐单胞菌Halomonas sp.IA02。

2.权利要求1的构建方法构建的重组嗜盐单胞菌。

3.权利要求2的重组嗜盐单胞菌催化柠檬酸制备衣康酸的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是包括如下步骤：

(1)将权利要求2的重组嗜盐单胞菌进行诱导培养；

(2)将步骤(1)获得的培养液，于4000-8000rpm，4-10℃离心10-20min，PB高渗缓冲液洗涤2-3次，用PB高渗缓冲液重悬，测定OD_600nm，收集获得重组嗜盐单胞菌；

(3)按比例，向容器中加入底物柠檬酸，使终浓度为500-600mM，步骤(2)获得的重组嗜盐单胞菌，使终浓度为30OD_600nm/mL，Trixon X-100使体积分数为0.1％-0.6％，余量为pH是6.0-6.5的0.01M PB缓冲液，混合均匀后在30-35℃反应，得到衣康酸。