[发明专利]重组嗜盐单胞菌及构建方法及催化柠檬酸制备衣康酸的应用

说明书

本发明公开了重组嗜盐单胞菌及构建方法及催化柠檬酸制备衣康酸的应用，一种重组嗜盐单胞菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：在野生型嗜盐单胞菌Halomonas sp.TD01基因组上整合Mmp1RNA聚合酶表达单元，并将其icd基因起始密码子ATG替换为TTG，得到Halomonas sp.TD2.0；向其中依次导入高拷贝表达载体pN59‑P_Mmp1‑RBS‑cadA‑acn和低拷贝表达载体pN85‑P_Mmp1‑RBS‑GroESL‑P_Mmp1‑RBS‑acn；得到重组嗜盐单胞菌Halomonas sp.IA02；该菌细胞催化可高效制备衣康酸。本发明周期短、简便、产率高。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组嗜盐单胞菌及构建方法及细胞催化柠檬酸制备衣康酸的应用。

背景技术

衣康酸(Itaconic acid，IA)，一种C5不饱和二元酸，是美国能源部公布的十二种最具价值的生物基平台化合物之一，广泛应用于合成树脂、塑料、合成纤维和制药领域等。目前主要通过土曲霉(Aspergillus terreus)发酵法生产，最高衣康酸产量可达160g/L。微生物体中从柠檬酸出发合成衣康酸有两个关键酶参与，概括见图1，即TCA循环中间产物柠檬酸经顺乌头酸酶(Aconitase，ACN)催化生成顺乌头酸，进一步在顺乌头酸脱羧酶(Cis-aconitate decarboxylase，CAD)作用下脱羧生成为IA。其他真菌如玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis，IA 最高产量205.6g/L)、拟酵母属(Pseudozyma sp.，最高产量74.7g/L)、假丝酵母属(Candida sp.，最高产量35g/L)等也具有天然合成衣康酸的能力。此外，异源真菌宿主也被改造用于发酵生产衣康酸，如黑曲霉(Aspergillus niger，最高产量42.7g/L)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica，最高产量22.03g/L)等。但真菌发酵法存在着糖耗高、发酵周期长、发酵过程难控和对氧敏感等缺点，选择生长快、培养条件宽松、易控的菌株作为宿主非常必要，所以后续又改造了大肠杆菌(Escherichia coli，最高产量47g/L)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum，最高产量7.8g/L)等细菌为宿主发酵合成衣康酸。但与土曲霉等真菌相比，细菌宿主发酵产生的衣康酸在效价和产率方面仍处于较低水平，没有竞争力。

2017年，一种生物催化策略——全细胞催化法，被Kim等人应用于衣康酸的生产中。选用易培养、生长快速的大肠杆菌全细胞作为生物催化剂，以廉价柠檬酸为底物高效合成衣康酸。通过引入和增强衣康酸合成关键酶ACN和CAD构建工程菌株，利用其全细胞转化系统，反应19h可催化500mM柠檬酸生成319.8mM衣康酸(41.61g/L)，转化率为63.96.0％，产率为2.19g/L/h。该方法简单、方便、高效且成本低，远优于传统发酵制备法，但反应体系中底物仍有大量剩余，不能完全转化，衣康酸产量和效率远不及大肠杆菌全细胞催化的其他产品(如尸胺、丙烯酰胺等)。这可能与衣康酸合成酶表达选用的异源宿主不适合、酶表达量少及酶活稳定性低等有关，进一步地筛选其他宿主和优化衣康酸合成酶表达是解决细胞催化高效制备衣康酸的关键问题。