[发明专利]磁分离荧光增强型适配体传感器检测肿瘤标志物CA19-9的方法

权利要求书

1.一种磁分离荧光增强型适配体传感器的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

步骤1、通过水热合成法制备羧基化石墨烯量子点GQDs-COOH；首先，将碳纤维分散在混酸溶液中，超声分散2h，在95℃条件下剧烈搅拌12h；然后，向烧瓶中加入弱有机酸柠檬酸，在相同温度下继续搅拌1h，得到GQDs-COOH；反应结束后，向烧瓶中缓慢加入超纯水；当混合物体系颜色发生改变时，向烧瓶中缓慢加入氢氧化钠溶液，将反应体系pH值调至1；再加入碳酸钠溶液，使pH值为8；将烧瓶放入冰浴中，使温度调节到4℃；在此温度下缓慢搅拌2min，沉淀溶液2-4h，去除沉淀物，将含有GQDs-COOH液体用1000KD透析袋透析3天，将溶液浓缩后冷冻干燥24h；

步骤2、制备聚乙二醇化石墨烯量子点GQDs-PEG：GQDs-COOH溶液中依次加入1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌15min；再加入10％PBS稀释的NH₂-PEG-NH₂，室温下与活化的GQDs-COOH孵育过夜，超滤离心管纯化、浓缩，得到GQDs-PEG颗粒；

步骤3、合成适配体化石墨烯量子点GQDs-PEG-Apt：羧基修饰的适配体Apt用EDC/NHS方法预处理15min；然后，将终浓度为1.95μmol/L的Apt加入到GQDs-PEG溶液中，室温下摇动过夜；终产物GQDs-PEG-Apt通过超滤离心管进行纯化和浓缩；

步骤4、采用水热法制备二硫化钼纳米片WS₂：将WS₂粉末原料加入到NaOH溶液中，30℃下持续搅拌18h，在90℃下缓慢蒸发至完全干燥；然后加入超纯水，重复上述操作3次，得到的固体在80℃下真空干燥12h，将固体分散在乙醇中，超声24h；1000r/min离心，弃去沉淀物，上清液15000r/min离心，收集的沉淀物即为WS₂纳米片；

步骤5、溶剂热法制备四氧化三铁纳米颗粒Fe₃O₄：将乙酰丙酮铁加入到乙醇中，室温下搅拌直至悬浮物均匀分布；将悬浮液转移到水热反应釜中，氮气下密封；反应釜在180℃下加热12h；冷却至室温，在氮气气氛下，用丙酮、乙醇和超纯水分别洗涤三次；磁场分离，收集黑色粉末产物即为Fe₃O₄纳米颗粒，冷冻干燥12h；

步骤6、组装WS₂/Fe₃O₄纳米复合物：含Fe₃O₄纳米颗粒的四氢呋喃THF溶液中，缓慢加入meso-2,3-二巯基琥珀酸DMSA，超声30min，对磁性Fe₃O₄纳米颗粒进行功能化处理；室温下搅拌2h，14800r/min离心去除溶剂；得到DMSA修饰的Fe₃O₄纳米颗粒；然后，将DMSA修饰的Fe₃O₄纳米颗粒，缓慢加入到含有WS₂纳米片水溶液中，超声作用30min；室温下搅拌6h，得到WS₂/Fe₃O₄纳米复合物悬浮溶液；

步骤7、构建GQDs-PEG-Apt/WS₂/Fe₃O₄磁分离荧光增强型适配体传感体系：取步骤6和步骤3中WS₂/Fe₃O₄纳米复合物悬浮溶液和GQDs-PEG-Apt溶液，37℃孵育25min，得到GQDs-PEG-Apt/WS₂/Fe₃O₄磁分离荧光增强型适配体传感体系溶液；

步骤8、磁分离荧光增强型适配体传感器定量检测CA19-9：取步骤7中GQDs-PEG-Apt/WS₂/Fe₃O₄溶液，与pH7.4磷酸盐缓冲溶液进行混合；之后在混合溶液中分别加入一系列不同浓度的肿瘤标志物CA19-9溶液，每个样品检测三次，取其平均值；荧光测量条件为：激发/发射狭缝固定为10nm/5nm，激发波长固定为359nm，荧光发射谱发射波长范围为400-600nm。