[发明专利]一种利用发酵培养法制备NMN的方法

权利要求书

1.一种利用发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，所述方法应用培养基培养酿酒酵母KH09制备烟酰胺单核苷酸，所述酿酒酵母KH09是以KH08菌株为出发菌株，经NMA1基因敲除制备得到，所述KH08的保藏编号为：CGMCC No. 19048；所述方法还包括在发酵过程中采用两阶段变温，所述两阶段变温为在20-40h前采用32-42℃发酵温度，在20-40h后采用25-35℃的发酵温度，其中后一阶段的温度低于前一阶段的温度；

所述方法还包括在发酵的不同阶段采用不同的溶氧水平培养，发酵培养的30-50h前控制最低溶氧水平为20-40％；发酵培养的30-50h后控制最低溶氧水平为2-8％；

所述发酵过程中的搅拌转速为150-500r/min，罐压控制在0.02-0.1MPa，通气量为0.5-2vvm；

所述培养基包括碳源和氮源，所述碳源包括葡萄糖，所述氮源包括酪蛋白水解物，所述葡萄糖的浓度为30-70g/L，所述酪蛋白水解物的浓度为10-50g/L；

所述培养基还包括KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、尿素、ZnCl₂、柠檬酸铁以及烟酰胺；

所述培养基还包括Triton X-100，所述Triton X-100添加量为0.2-1.0％；

所述NMA1基因敲除的方法具体包括：(1)合成NMA1基因敲除片段；(2)应用酿酒酵母KH08制备酿酒酵母感受态细胞；(3)取步骤(1)得到的NMA1基因敲除片段加入至步骤(2)得到的酿酒酵母感受态细胞中，进行电转化，应用培养基培养得到转化液，对上述转化液进行培养得到转化子，挑取转化子划线纯化，用酵母基因组提取试剂盒提取基因组，用引物对NMA1-F1/NMA1-R1进行PCR验证敲除正确，得到酿酒酵母KH09；

所述NMA1基因敲除片段为：

GAATAAACACACATAAACAAACAAAATGGATCCCACAAGAGCTCCGTTAAGCAAGTTCTTGGAAACAAAGAATGAACCCGGGGCGAATTTCTTATGATTT；

所述引物对NMA1-F1/NMA1-R1的序列为：

NMA1-F1：GAATAAACACACATAAACAAACAAAATGGATCCCACAAGAGCTCC；

NMA1-R1：AAATCATAAGAAATTCGCCCCGGGTTCATTCTTTGTTTCCAAGAACTTGCTTAAC。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述两阶段变温为在30h前采用37℃发酵温度，在30h后采用30℃的发酵温度。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵培养的40h前控制最低溶氧水平为30％；发酵培养的40h后控制最低溶氧水平为5％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为50g/L，所述酪蛋白水解物的浓度为30g/L。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中，KH₂PO₄的浓度为21.17g/L、MgSO₄·7H₂O的浓度为10g/L、尿素的浓度为10g/L、ZnCl₂的浓度为0.01g/L、柠檬酸铁的浓度为0.05g/L以及烟酰胺的浓度为24g/L。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Triton X-100添加量为0.5％。