[发明专利]一种利用发酵培养法制备NMN的方法

说明书

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种利用一步发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸的方法。所述方法应用培养基培养酿酒酵母KH09制备烟酰胺单核苷酸，所述方法还包括在发酵过程中采用两阶段变温，所述两阶段变温包括在20‑40h前采用32‑42℃发酵温度，在20‑40h后采用25‑31℃的发酵温度。所述方法中培养酿酒酵母KH09的培养基包括碳源和氮源，所述碳源包括葡萄糖，所述氮源包括酪蛋白水解物，所述葡萄糖的浓度为30‑70g/L，所述酪蛋白水解物的浓度为10‑50g/L。本发明所述方法的原料成本低，操作简单，反应彻底，转化率、生产效率高，易实现产业化、规模化生产。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及利用发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide mononucleotide，简称β-NMN或者NMN)是人体中的一种内源性物质，参与细胞内烟酰胺嘌呤二核苷酸(NAD+)的合成，是其重要并且最直接的前提物质。在人体内，NMN通过转化为NAD+发挥其生理功能，如激活NAD+底物依赖性酶Sirt1(组蛋白脱乙酰酶，又称沉默调节蛋白)、调节细胞存活和死亡、维持氧化还原状态等，但它会随年龄增长而逐渐减少。由于NAD+分子量过大，很难被人体吸收，NAD+的补充只有通过摄取分子量较小的NMN等前体物质来实现。NMN也存在于日常饮食的多种蔬菜和水果中，但含量极其微量，摄入的量远远不足，所以需要额外补充。近年研究发现，人为补充NMN可以明显提高体内的NAD+水平，抑制衰老引起的认知能力下降，保护心脑血管功能，提升体能，延长寿命，还可以调节内分泌，防治糖尿病等代谢性疾病，保护视力和听力等。

目前制备NMN的方法主要有化学合成法和体外酶转化法。化学法工艺复杂，成本高，收率低，并可能产生许多顺式异构体及大量的有毒副产物，造成环境污染，限制了其应用。体外酶转化法虽具有污染小、反应简便等特点，但其需先提取具有活性的酶，增加工艺成本，且酶在提取过程中及体外易失活，导致NMN酶转化存在耗时长和收率低等问题，周期长、生产效率低难以实现较大规模生产。微生物发酵是一个极为复杂的生化反应过程，基质、温度、pH等种种因素都对微生物的生长和产物的形成分泌都会产生影响。一步发酵法为由糖质原料经利用直接生成产物的过程，培养基成分简单、成本低、方法简单实用、易于操作、前景广阔，是一种绿色、高效的生产方法。

发明内容

本发明的目的一方面是填补现有制备烟酰胺单核苷酸技术空白，另一方面是克服现有的烟酰胺单核苷酸制备工艺的缺陷，在实验室现有菌种的基础上，通过发酵工艺优化及过程控制利用微生物一步发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸，其原料成本低，操作简单，反应彻底，转化率、生产效率高，易实现产业化、规模化生产。

本发明的目的是这样实现的：

在一个实施例中，本发明提供一种利用发酵培养法制备烟酰胺单核苷酸的方法，所述方法应用培养基培养酿酒酵母KH09制备烟酰胺单核苷酸，所述酿酒酵母KH09是以保藏菌株KH08为出发菌株，经简单酶切制备得出，KH08的保藏编号：CGMCC No.19048；所述方法还包括在发酵过程中采用两阶段变温，所述两阶段变温包括在20-40h前采用32-42℃发酵温度，在20-40h后采用25-35℃的发酵温度，其中需保证后一阶段的温度低于前一阶段的温度。优选地，所述两阶段变温包括在25-35h前采用34-40℃发酵温度，在25-35h后采用27-33℃的发酵温度。

所述以保藏菌株KH08为出发菌株，经酶切制备得到酿酒酵母KH09，具体包括：(1)合成NMA1基因敲除片段；(2)应用酿酒酵母KH08制备酿酒酵母感受态细胞；(3)取步骤(1)得到的NMA1基因敲除片段加入至步骤(2)得到的酿酒酵母感受态细胞中，进行电转化，应用培养基培养得到转化液，对上述转化液进行培养得到转化子，挑取转化子划线纯化，用酵母基因组提取试剂盒提取基因组，用引物对NMA1-F1/NMA1-R1进行PCR验证敲除正确，得到酿酒酵母KH09。

优选地，合成的NMA1基因敲除片段为(双链片段，以下展示为单义链)：